中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (9): 1078-1080   PDF    
引用本文
李荔, 吴曾闵, 刘志刚. 紫红笛鲷过敏原小清蛋白基因克隆及序列分析[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(9): 1078-1080.
LI Li, WU Zeng-min, LIU Zhi-gang Cloning and sequence analysis of allergenic parvalbumin gene from red snapper(Lutianus argentimaculatus)[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(9): 1078-1080.
紫红笛鲷过敏原小清蛋白基因克隆及序列分析
李荔, 吴曾闵, 刘志刚     
深圳大学生命科学学院过敏反应与免疫学研究所, 深圳 518060
收稿日期: 2008-02-22
基金项目: 国家“863”计划项目(2006AA100308);广东省科技重点专项(2003A3080502);深圳市科技计划项目(200326)
作者简介: 李荔(1968- ),女,辽宁岫岩人,副教授,博士,主要从事动物过敏反应及相关研究。
通讯作者: 刘志刚
摘要： 目的 克隆紫红笛鲷(Lutianus argentimaculatus)过敏原小清蛋白(parvalbumin)基因。 方法 采用生物信息学方法对多种鱼的小清蛋白基因进行序列性比对,根据序列保守区域设计并合成简并性引物,通过实时(RT)-PCR和3'cDNA末端快速扩增RACE技术克隆紫红笛鲷小清蛋白的全长基因,并进行序列分析。 结果 获得紫红笛鲷全长608 bp的新基因,开放阅读框为330个碱基,编码109个氨基酸,经分析该蛋白分子量约为11.5kD,等电点为4.35。序列分析结果显示所克隆的基因与其他鱼类过敏原小清蛋白基因有很高的同源性。 结论 成功克隆出紫红笛鲷过敏原小清蛋白基因(登录号为:EF591789)。
关键词： 紫红笛鲷     过敏源     小清蛋白     基因克隆    
Cloning and sequence analysis of allergenic parvalbumin gene from red snapper(Lutianus argentimaculatus)
LI Li, WU Zeng-min, LIU Zhi-gang     
College of Life Science, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China
Abstract: Objective To clone allergenic parvalbumin genes from red snapper. Methods All the known parvalbumin gene sequences from several fish species were compared by bioinfor matic method and the highly conserved domains were selected for degenerative primer designing.The RT-PCR and 3'-RACE methods were applied to clone the full-length parvalbumin cDNA from red snapper. Results Our data indicated that the full-leng th cDNA of red snapper parvalbumin containsed 608 bp nucleotides.It encodes a 109 amino acid protein with an estimated molecular weight of approx imately 11.5 kD and an isoelectric point of 4.35.The predicted pro tein sequence showed high homology with aller genic parvalbumin from many other fish species. Conclusion An allergenic par valbumin gene was cloned from red snapper(access number: EF591789).
Key words: red snapper     allergen     parvalbumin     gene cloning    

过敏性疾病被世界卫生组织认定为当前世界性的重大卫生学问题之一。通过免疫反应而引起的食物过敏中，鱼类占大多数。小清蛋白是一种钙结合肌浆蛋白，鳕鱼(cod)的过敏原Allergen M Gad c 1、鲑鱼(salmon)的过敏原 Sal s l均为小清蛋白，并且小清蛋白作为过敏原在鱼类中存在着交叉反应，已确定小清蛋白是鱼类的主要泛变应原[1-5]。国外对主要鱼类过敏原进行了分离、鉴定和纯化，建立了鳕鱼、鲤鱼、鲑鱼、鲭鱼等过敏原的cDNA文库，并进行克隆与表达，构建出重组变应原[1, 6]。目前国内也有相关研究报道[7]。紫红笛鲷(Lutianus argentimaculatus)是我国南方地区的食用海水鱼类，常引起过敏病发生，本研究在对其过敏原小清蛋白进行分离鉴定的基础上，对其过敏原基因进行克隆和分析，为进一步重组表达该过敏原蛋白奠定基础。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

海水鱼类紫红笛鲷(海南省海口市农贸市场)。原核表达载体pET-28a(+)(Invitrogen公司)，T/A克隆试剂盒、Taq酶、DNA胶纯化试剂盒(日本TaKaRa公司)；RNA提取试剂盒(美国Qiagen公司)；第一链cDNA合成试剂盒(美国BBI公司)。

1.2 引物设计

从SWISS-PROT和TrEMBL(http://www.expasy.org)以及NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank等数据库下载多例鱼类小清蛋白基因序列。利用Clustal W (1.82)程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)对这些序列进行同源性比较，确定其保守区域。根据保守区域设计并合成简并性引物(上海生工公司合成)：p5:5′-ATG GC (C/A) TTC GCC GG(T/A) (G/A)T TCT-3′；p3:5′-AAG TTC TGC AGG AAC AG(T/C) TT-3′ 。

1.3 总RNA提取及RT-PCR

称取紫红笛鲷约100 mg 肌肉，按试剂盒说明书提取RNA。利用第一链cDNA合成试剂盒进行cDNA合成。以合成的单链cDNA为模板，利用简并引物进行PCR反应，检测PCR产物，并回收。

1.4 TA克隆及测序

回收纯化的RT-PCR产物与pMD18-T Vector连接，并转入E.coli Top 10。经菌落PCR(载体引物)验证后，取阳性菌落培养过夜进行序列测定(上海生工公司完成)。

1.5 3′-RACE及全长基因获得

由于采用简并性引物克隆的cDNA片段产并不是全长基因，因此，根据测序结果设计基因的特异性引物3′ RACE:5′-TGCCGTGATTGACCAGGACA-3;按试剂盒说明书对cDNA 的3′ 端进行快速扩增。回收扩增产物，连入pMD18-T载体，转化E.coli Top 10,选取阳性克隆进行测序。对测序结果进行分析，然后与已得到的序列拼接获得过敏原基因的全长序列。

1.6 序列分析及同源性比较

根据所得的基因序列推测获得相应的氨基酸序列，并对推导的蛋白质等电点和相对分子量进行评估(http://www.expasy.org)。利用CLUSTAL W (1.82)程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)进行序列同源性比较，并将美国太平洋鲭鱼、竹荚鱼、无备平鱼由以及锦鲤的小清蛋白基因进行多序列比对。

2 结果 2.1 RT-PCR扩增获得目的基因片段(图 1)

图 1中可见到一个大约为230bp的清晰条带，其大小与理论预计值相符合。

注：1：DNA标准；2：用 p5 和 p3 为引物的RT-PCR片段。 图 1 RT-PCR扩增结果

2.2 3′-RACE及全长基因获得

扩增产物约为 600 bp，回收后连接入载体并转化E.coli Top 10。选取阳性克隆进行测序。将测序结果与非全长序列进行拼接，得到紫红笛鲷小清蛋白基因的全长序列。

2.3 序列分析(图 2)

图 2可见，拼接后的全长基因由608个碱基组成，其中开放阅读框为330 bp(包括终止密码子)，该阅读框能编码由109个氨基酸组成的蛋白。经分析该蛋白的分子量约为11.5 kD，等电点为4.35。该基因己被GeneBank数据库收录，登录号为EF591789。

图 2 紫红笛鲷小清蛋白核酸序列及推导的氨基酸序列

2.4 同源性比较(图 3)

结果显示，紫红笛鲷的小清蛋白氨基酸序列与其他鱼类泛变应原小清蛋白的氨基酸序列有较高的同源性，与美国太平洋鲭鱼(AB211366)和竹荚鱼(AB211365)小清蛋白的同源性分别为74%和76%；与无备平鱼由(DQ374441)的同源性为72%，与鲤鱼(AJ292212)的同源性最高，达到86%。进化树可见，美国太平洋鲭鱼与竹荚鱼的小清蛋白聚成一簇，说明它们之间的同源性很高，进化关系很近。紫红笛鲷与锦鲤小清蛋白聚成一簇，进化关系较近。

注：1：紫红笛鲷；AB 211366：美国太平洋鲭鱼；AB 211365：竹荚鱼；DQ 374441：无备平鱼由；AJ 292212：锦鲤。 图 3 紫红笛鲷小清蛋白基因与其他鱼类小清蛋白基因的分子进化树

3 讨论

鱼类的主要过敏源是肌肉中的小清蛋白，小清蛋白具有热稳定、水溶性，以及用变性剂极端处理时也能够保持稳定的特点3-5。Y Hamada 等对日本鲭的小清蛋白进行了cDNA克隆，得到了一个长度为327bp的编码区，推导其氨基酸序列，并与其他种类鱼的小清蛋白进行同源比较，发现同源性很高。该实验同时指出了同一种鱼的小清蛋白可以具有不同亚型，如鲑鱼有β1与β2型[6, 8]。龚小玲等克隆了变态期牙鲆鱼的小清蛋白基因，其全长为603 bp，编码109个氨基酸[7]。本实验克隆的紫红笛鲷小清蛋白的全长基因为608 bp，编码109个氨基酸，蛋白的分子量约为11.5 kD，该实验结果与鳕鱼、鲭鱼、鲑鱼[1, 6, 8]的小清蛋白基因相似。通过比较发现紫红笛鲷小清蛋白基因编码的蛋白与其他鱼类过敏原小清蛋白有较高的同源性。

由于小清蛋白做为过敏原在鱼类中存在着交叉反应[2-5]，对某种鱼过敏者也可能同时对其他的鱼类过敏[9]，所以针对紫红笛鲷小清蛋白基因的研究，有助于对其他鱼类过敏机制的研究。目前，由于各种原因，我们很难纯化得到高质量的、有活性的天然过敏源，许多过敏反应研究受到限制，所以用重组蛋白来替代天然过敏原研究具有重要意义[10]。本研究克隆出紫红笛鲷小清蛋白变应原基因，为其特异性重组过敏原表达和纯化奠定了基础，为鱼类食入性过敏疾病的诊断和脱敏治疗提供了理论依据。

参考文献
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