脓毒症指由感染引起的全身炎症反应综合征,它是严重烧伤、休克、外科手术后常见的并发症。目前常规的细菌培养与鉴定方法只能说明是否为金黄色葡萄球菌感染,并不能了解感染菌产肠毒素情况,更不能直接检测肠毒素在体内的变化特点。为了解金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)在烧伤脓毒症和休克综合征中的变化特点及作用机制,本研究建立双抗体夹心酶联免疫吸附方法,选择金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)进行快速检测。结果报告如下。

选取广州市红十字医院烧伤患者54 例,其中轻度烧伤34 例(烧伤面积[50%),重度烧伤(烧伤面积> 50%)20 例; 选择该院同期门诊患者54 例做为对照组,年龄构成、性别比例与烧伤患者组的差异无统计学意义。分别于入院后24 和72 h 采集2 组患者血样,离心后留取血清,放于4 e 冰箱保存。

金黄色葡萄球菌肠毒素B 标准品(批号: 81-BCM-2)及兔抗SEB 抗体(军事医学科学院微生物流行病研究所); 抗SEB 单克隆抗体为本单位制备^[1],标记的链亲素和酶联反应底物-四甲基联苯胺(T NB,华美生物公司)。酶联免疫测定仪为DE-3022。酶结合物: 用改良的过碘酸钠^[2]标记抗SEB 单克隆抗体。

分别以5,10,15,20 μg/L 兔抗SEB 单克隆抗体包被微孔板,加入按101 000,51 000,21500,11250,01 625 μg/L系列稀释的SEB 标准品和酶标抗体(1B500),测定吸光度(A )值包被微孔板,以生物素标记的抗SEB 单克隆抗体作为标记抗体,双抗体夹心法按文献[1]进行。轻度烧伤、重度烧伤及对照组患者血清中SEB 含量测定程序为: 包被-封闭-加样-加酶标抗体-底物显色-测定吸光度值。

采用SPSS/ PC 101 0 软件进行分析,定量资料两两比较采用t 检验,定量资料多组比较采用方差分析。

表 1 可见,以5 和10μg/L SEB 单抗包被时,各浓度A 值均明显高于其他组。因此,当SEB 浓度较低时,选择10μg/L 做为作为包被浓度。

表 1

表 1 不同抗体包被浓度时SEB 的吸光度(A) 值

表 1 不同抗体包被浓度时SEB 的吸光度(A) 值

检测结果显示,严重烧伤组20 例中,SEB 检测阳性18 例,占90%; 轻度烧伤组34 例中,SEB 检测阳性24 例,占701 6%; 对照组54 例中,SEB 检测阳性34 例,占631 0%。与对照组比较,严重烧伤者血清SEB 阳性率差异有统计学意义(χ²= 51 106 8,P＜0.05),严重烧伤组与轻度烧伤组比较、轻度烧伤组与对照组比较,SEB 检出阳性率差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表 2 可见,血清SEB 阳性者中,以严重烧伤患者血清中SEB 含量最高,其次为轻度烧伤组。方差分析结果显示,F = 971 454,P＜0.01。其中严重烧伤组患者与正常对照组和轻度烧伤组比较,差异有统计学意义(P＜0.01),正常对照组和轻度烧伤组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。严重烧伤患者组中,入院72 和24 h 比较,以入院后24 h 明显高于72 h 结果,差异有统计学意义。

表 2

表 2 烧伤和对照组患者SEB 水平的变化(μg/L,x±s)

表 2 烧伤和对照组患者SEB 水平的变化(μg/L,x±s)

金黄色葡萄球菌肠毒素B 是一种很强的促分裂原和超抗原,具有广泛的免疫调节作用^[3],且性质稳定,易于大量生产和制成气溶胶散布,已成为重要的生物战剂。鉴于SEB 在平时战时都具有重要意义,故研制定量测定SEB 的试验方法,对于探讨SEB 在烧伤脓毒症和休克综合征中的变化特点及作用机制具有重要意义。

国内李红云^[4]等人采用大鼠30%面积三度烧伤合并金黄色葡萄球菌攻击所致严重金黄色葡萄球菌脓毒症模型,探讨SEB 在脓毒症中的变化规律和致病机制。结果表明,烧伤后金葡菌感染动物血浆SEB 水平迅速升高,至24 h 时明显高于烧伤前值。病理形态学检查证实,烧伤后运用抗SEB 单克隆抗体早期干预动物,可使死亡率明显降低,从而证实了SEB对金葡菌脓毒症的作用。

本研究在制备抗SEB 单克隆抗体的基础上,建立了双抗体夹心法检测SEB,检测的灵敏度可达0.1μg/L 左右。检测结果表明,严重烧伤组患者与正常对照组和轻度烧伤组比较,SEB 含量的差异有统计学意义(P＜0.01)。同时,SEB 可在24h 达到高峰,入院72h 后SEB 结果仍明显高于对照组和轻度烧伤患者组。本方法可初步用于动态监测烧伤病人血浆中SEB 水平的变化,有利于制定相应的治疗方案,还可为进一步探讨SEB 在烧伤脓毒症和休克综合征中的变化特点及作用机制提供良好的技术基础。