微囊藻毒素污染与人类健康的关系问题已引起全球的广泛关注。微囊藻毒素-LR (microcystin-LR ,MCLR)是一种具有肝脏毒性的单环多肽毒素,是微囊藻毒素中毒性最强的一种。研究表明,MCLR 可以增加细胞内的活性氧(reactiveoxygen species ,ROS)的形成^[1]。Ding 等^[2]报道,MCLR 引起原代培养大鼠肝细胞产生DNA 链的断裂损伤。DNA 链的断裂损伤有很多种原因,因此,它不是ROS 引起的特异性的氧化性DNA 损伤标志物^[3]。8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷(8-O-HdG)是ROS 攻击DNA 分子中的鸟嘌呤碱基第8 位碳原子而产生的一种氧化性加合物,它是氧化性DNA 损伤中主要的和最重要的标志物^[4]。有机阴离子转运多肽(OATP)家族的OATP1B1 和OATP1B3 是特异性分布于肝细胞基底外侧(窦状)质膜上的转运蛋白,负责介导胆酸盐等物质的跨细胞转运^[5]。本研究选取高表达OATP1B1 的HT17 细胞株和不表达OATP1B1 或1B3 的Hep G2 细胞株^[5],比较2 种人肝癌细胞株对MCLR 的毒性差异,利用较敏感的细胞株进一步研究MCLR 对人类细胞的氧化性DNA 损伤作用。

HT17 细胞和Hep G2 细胞(日本东北大学老年医学研究所细胞资源中心惠赠)。MCLR 纯度＞98 %(瑞士AL EXIS 公司),临用时用0.1 %二甲基亚砜溶解。二甲基亚砜(DMSO)(日本和光纯化学工业公司);鼠抗8-O2HdG单克隆抗体IF7 (美国R & D Systems 公司);过氧化物酶试剂盒和3 ,3′2 二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(美国Vector Laboratories 公司);四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)(日本同仁化学研究所);青霉素和链霉素(美国Gibco-BRL 公司);伊格尔最低必需培养基(MEM)和改良的伊格尔(DMEM)培养基(美国Sigma 公司)。

HT17 细胞在含10 %加热失活小牛血清及100U/ ml 青霉素、100μg/ ml 链霉素,于MEM 培养基中,置37 ℃,5 % CO₂ 和95 % O2 条件下培养。Hep G2 细胞用DMEM培养基培养,培养条件同前。收集对数生长期细胞,调节细胞数为2 ×10⁵/ ml ,培养24 h 后,换成含有不同剂量MCLR 的培养液继续培养,培养24 h 后,在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。

HT17 细胞和Hep G2 细胞以每孔1 ×10⁴ 个分别接种于96 孔板,培养24h 后,加入MCLR ,使毒素的浓度为0.2 ,0.5 ,1.0 ,2.0 和5.0μg/ ml ,并以0.1 %DMSO 作空白对照,每个剂量组设2 个平行样,继续培养24 h后,每孔加50μl MTT ,37 ℃继续孵育3 h ,小心吸尽孔板中的培养液,加入100μ1 DMSO ,室温下摇床振荡5 min 后,用酶标仪(日本Tosoh 公司)测定570 nm 波长处的吸光度(A )值。细胞存活率= (实验孔A 值/ 对照孔A 值)×100 %。

主要参照文献[6]的方法并稍作改进。

采用SPSS 11.0 统计软件处理数据。细胞毒性测定和8-OHdG含量测定分别采用方差分析的Tukey检验和Dunnett’s T₃ 检验。

(1) 在倒置显微镜下观察发现,当MCLR 的剂量增加到1.0μg/ ml 时,HT17 出现细胞收缩、变圆,失去正常细胞间的紧密连接,呈悬浮生长,一些细胞脱离培养基后,凝集成团块状,细胞核变得模糊不清,活细胞数量减少。与之相反,Hep G2 细胞贴壁稳定生长,细胞间相互紧密连接。细胞形态呈梭形,核圆、清晰。(2)用MTT 法定量检测细胞毒性时发现,不同剂量的MCLR处理HT17 细胞24h 后,低剂量处理(≤0.5μg/ ml)未见细胞毒性。但随着处理浓度的增加,HT17 细胞存活率显著降低,存在明显的剂量-反应关系。最高剂量组(5.0μg/ ml )的HT17 细胞存活率是对照组的(50.42 ±3.98)%。在1.0 ,2.0和5.0μg/ ml 3 个剂量点上,HT17 细胞的存活率均明显低于Hep G2 细胞。与空白对照组比较,Hep G2 细胞的存活率在任一剂量点上均无显著改变(图 1)。

图 1

注:与空白对照组比较,a P＜0.01 ;与HepG2 组比较,b P＜0.01 。 图 1 不同剂量MCLR处理HT17 和HepG2 细胞的毒性效应

用免疫酶染色法检测HT17 细胞内8-OHdG时发现,8-OHdG染色主要位于细胞核内。在空白对照组细胞可以观察到清楚的本底,呈浅棕色,而0.2～2.0μg/ ml MCLR 处理后的细胞核呈现明显的深棕色。利用图像分析软件进行定量,0.2 ,0.5 ,1.0和2.0μg/ ml 剂量组的8-OHdG 染色强度值分别为0.42 ±0.04 ,0.46 ±0.05 ,0.48 ±0.04 和0.55 ±0.08 。非毒性剂量(0.2 和0.5μg/ ml)MCLR 处理的细胞8-OHdG染色强度明显高于空白对照组(0.34 ±0.02),(P＜0.01),且随处理剂量的增加,8-OHdG 的染色强度亦增加。表明随着MCLR 处理剂量的增加,细胞内的8-OHdG含量亦增高。

MCLR 是一种毒性很强的肝毒素,能强烈抑制细胞丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(proteinp hosphatases ,PP)PPl 和PP2A 的活性,打破细胞内蛋白磷酸化/ 脱磷酸化的平衡,产生细胞毒性作用^[1]。本研究发现,1μg/ ml 以上剂量的MCLR 能抑制HT17 细胞的增殖与活性,这个毒性剂量范围与原代培养大鼠肝细胞相近^[7]。高表达OATP1B1 的HT17 细胞对MCLR的敏感性高于不表达OATP1B1 或OATP1B3 的Hep G2 细胞,这与Monks 等^[5]采用表达OATP1B1 和OATP1B3 的HeLa 转染细胞检测MCLR 毒性的结果一致,提示OATP1B1介导MCLR 的转运在MCLR 毒性发挥中起非常重要的作用。Hep G2 和HL60 等细胞不表达OATP1B1 或OATP1B3 ,MCLR 不容易进入细胞产生毒性作用。

本研究采用免疫酶染色法检测细胞内8-OHdG 的含量。此法不用对DNA 进行分解处理,不需要较昂贵的仪器,特异性强。单克隆抗体IF7 对8-OHdG的特异性已为竞争性EL ISA 实验所证实。免疫酶染色法与高效液相色谱-电化学检测器分析(HPLC-ECD)法之间有非常好的线性关系,可以避免DNA 分解处理过程中导致的假阳性结果^[6]。本研究发现,MCLR 处理HT17 细胞24 h 后,引起8-OHdG水平明显升高,染毒量与8-OHdG 水平之间呈现剂量-反应关系,提示MCLR 能引起细胞氧化性DNA 损伤。非毒性剂量的MCLR 亦诱导8-OHdG 的形成,提示观察到的氧化性DNA 损伤可能不是继发于细胞毒性。

在复制过程中,DNA 链上的8-OHdG可以与C 以外的其他碱基配对,引起G:C-T :A 颠换突变,在基因突变、细胞癌变以及肿瘤生长中起着重要作用^[7]。非毒性剂量的MCLR 引起氧化性DNA 损伤提示长期接触低剂量的MCLR可能对人类健康产生潜在的远期危害,因此,应加强环境水体的中微囊藻毒素-LR 的监测。