中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (7): 877-878   PDF    
引用本文
杨丽萍, 杨会利, 李忠, 王显军, 赵仲堂. 山东省泰安市鼠类自然感染恙虫病东方体调查[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(7): 877-878.
YANG Li-ping, YANG Hui-li, LI Zhong, et al. Investigation on rodents’ natural infection of Orientia tsutsugamushi in Tai’an area of Shandong, China[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(7): 877-878.
山东省泰安市鼠类自然感染恙虫病东方体调查
杨丽萍1, 杨会利2, 李忠3, 王显军3, 赵仲堂1     
1. 山东大学公共卫生学院流行病与卫生统计学研究所, 济南 250012;
2. 山东省泰安市疾病预防控制中心;
3. 山东省疾病预防控制中心传染病所
收稿日期: 2007-10-18
基金项目: 国家自然科学基金(30371237);高等学校博士学科点专项科研基金(20050422052)
作者简介: 杨丽萍(1978- ),女,山西原平人,博士,研究方向:分子流行病学。
通讯作者: 赵仲堂
摘要: 目的 了解山东省泰安地区鼠类自然感染恙虫病东方体(Ot)的情况。 方法 应用巢式PCR对山东省泰安地区采集的鼠类标本Ot-Sta56kDa基因片段进行检测,对阳性标本进行序列分析。 结果 在泰安地区秋冬季共捕获鼠类68只,阳性率为5.88%;不同鼠种间阳性率差异无统计学意义(Fisherχ2=4.714,P=0.062)。其中3只鼠胚胎标本均未检出Ot。序列同源性分析显示,2只鼠脾标本(08P,53P)的核苷酸序列与Sdu-1型的核苷酸序列同源性最高,为99.77%;其次,与Taguchi和Oishi型的同源性均为95.98%,与Kanda和Kawasaki型的同源性均为95.74%。而另2只鼠类标本(55P,56P)的核苷酸序列与TA686型的同源性最高,分别为86.27%和77.11%。系统发生树分析也显示,08P和53P与Sdu-1型在同一分支,它们又与Kawasaki、Kanda、Taguchi和Oishi型共处于同一分支;而55P和56P与TA686型在同一分支。 结论 山东省泰安地区鼠类存在Ot自然感染。该地区Ot的基因型较为复杂,不仅存在与临沂地区相同的Ot型,该型与日本的Kawasaki型相似;同时还存在与泰国的TA686型相似的Ot型。
关键词： 恙虫病     鼠类     恙虫病东方体     分子流行病学    
Investigation on rodents’ natural infection of Orientia tsutsugamushi in Tai’an area of Shandong, China
YANG Li-ping, YANG Hui-li, LI Zhong, et al     
Department of Epidemiology and Health Statistics, School of Public Health, Shandong University, Ji'nan 250012, China
Abstract: Objective To investigate rodents.natural infection of Orientia tsutsugamushi(Ot)in Tai'an area of Shandong,China. Methods The Ot-Sta56KDa gene of ro dents captured from Tai'an was identified by nested poly merase chain reaction(nPCR).Positive samples were sequenced,and the DNA sequences were compared with nucleotide sequences of Ot registered in GenBank for sequence homology analysis.Phylogenetic analysis about the Ot in Tai'an and some published sequences was carried out with Neighbor-joining method by MEGA3.1 software. Results Atotal of 68 ro dents were captured in Tai'an area,including 24 Apodemus agrarius,34 Rattus norvegicus and 10 Mus musculus.The overall positive rate of rodents with infection of Ot was 5.88%.There was no significant difference in infection rates among the rodents species(Fisher χ2=4.714,P=0.062).In addition,3 embryos without Ot infection of rodents were captured.Comparing with the sequences of Ot registered in GenBank,the Ot-Sta56 nucleotide sequences of 08Pand 53Pboth shared 99.77% of homology with Sdu-1 strain,95.98% with Tag uchi and Oishi strains,and 95.74% with Kanda and Kaw asaki str ains.The nucleot ide sequence of 55P shared 86.27% of homology with TA 686 str ain founded in Thailand,and the sequence of 56P shared 77.11% homology with TA 686 strain.Phylogenetic analysis showed that 08P and 53P were in the same branch with Sdu1 strain,and 55P and 56P were in the same branch with TA686 strain. Conclusion This study indicated that Ot infection was presented in rodents from Tai'an.The genotypes of Ot were complex in Tai'an,with some were similar to Kawasaki strain and others were similar to TA686 strain in Thailand.
Key words: scrub typhus     rodent     orientia tsutsugamushi     molecular epidemiology    

恙虫病是由恙虫病东方体（Orentia tsutsugamushi,Ot）引起的一种自然疫源地疾病，鼠类为主要传染源，通过恙螨幼虫叮咬而传播。1986年以前，我国恙虫病在南方的广大地区流行，且流行形式主要为夏季型；1986年以来，我国许多北方地区出现了秋冬型恙虫病。自1986年在山东省沂蒙山区首次发生恙虫病流行以来[1]，新的疫区不断出现[2]。1988年11月和2000年9～10月在泰安地区也出现了恙虫病的暴发流行[3, 4]，但当地鼠类自然感染恙虫病东方体的情况一直不清楚。为此，我们于2006年9～12月对泰安地区鼠类自然感染Ot的情况进行了调查。现报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标本采集

2006年9～12月，由山东省泰安市疾病预防控制中心在泰安市采集鼠类标本。以花生米、油条等为诱饵，采用鼠笼、鼠夹捕鼠，幕放晨收。鉴别鼠种，分离鼠脾。

1.1.2 主要试剂

Ex Taq PCR试剂盒和DL2000 DNA Marker（英国TaKaRa公司）;PCR产物凝胶回收试剂盒（美国Omega公司）。其他化学试剂均为分析纯（国产）。

1.2 方法 1.2.1 引物、DNA提取和nPCR扩增

引物、DNA提取，第1轮PCR，第2轮PCR的扩增体系及反应条件按文献[5]进行。

1.2.2 nPCR扩增产物的纯化及序列测定

采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(美国Omega公司)，按说明书从凝胶中回收nPCR产物。将纯化回收的PCR产物送上海Invitrogen生物技术有限公司，采用双脱氧末端终止法在ABI3730测序仪上进行序列测定。

1.2.3 序列同源性分析和系统发生树分析

登陆美国国家生物技术信息中心网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，将测序结果与GenBank中注册的序列进行比较。用MEGA 3.1软件中的Neighbor-joinjing(NJ)法，1 000次的Bootstrap分析重复数，对所测到的序列与GenBank中部分Ot参考序列进行序列同源性分析，绘制系统发生树。

1.3 统计分析

采用SPSS 11.5软件进行分析，应用χ2检验比较不同宿主动物感染率的差异。

2 结果 2.1 nPCR扩增

在泰安地区秋、冬季捕获各种鼠类共计68只，从其中4只鼠脾提取的模板DNA扩增出481～507bp大小的目的条带，总阳性率为5.88%。不同的鼠种间阳性率差异无统计学意义（Fisher χ2=4.714，P=0.062）。另外，从捕获鼠中获得3只鼠胚胎标本，2份为褐家鼠，1份为黑线姬鼠，从这些母体鼠的脾脏和胚胎中均未检出Ot。

2.2 同源性分析和系统进化树分析(图 1)

对各阳性标本的nPCR扩增产物纯化回收后，进行核苷酸序列的测定。将测序结果在NCBI网站上，与GenBank注册序列做Blast比较与分析。结果显示：08P和53P标本的nPCR产物的核苷酸序列完全相同，与Sdu-1型的核苷酸序列同源性最高，为99.77%；其次，与Taguchi和Oishi型的同源性均为95.98%，与Kanda和Kawasaki型的同源性均为95.74%。55P（GenBank注册号EF543196）和56P标本的核苷酸序列与TA686型的同源性最高，分别为86.27% 和77.11%。系统发生树分析显示，山东省泰安地区2份鼠类标本（08P，53P）与Sdu-1型在同一分支，它们又与Kawasaki、Kanda、Taguchi和Oishi型共处于同一分支；而另2份鼠类标本（55P，56P）与TA686型在同一分支。

注: GenBank 中的序列号: Karp (M33004) , Kato (M63382 ) , Kaw asaki(M63383) ,Kuroki(M63380) , Hualien-2 (AY525145) , Kanda(AF173039 ) ,Taguchi (AF173038 ) , Sdu-1 (DQ489310 ) , Boryon (L04956 ) , Yonchon(U19903) ,TW461 (AY222631 ) , Sxh951(AF050669) , TA686 (U80635 ) , Oishi(AF173037) ,UT177(EF213084) 。 图 1 山东泰安地区鼠类感染Ot 的核苷酸序列进化树分析(NJ 法)

3 讨论

山东省恙虫病的主要贮存宿主为黑线姬鼠[6]，它是本省野外的优势鼠种。本次研究也证实了黑线姬鼠为泰安地区恙虫病的主要贮存宿主，同时从1只小家鼠中扩增出Ot-DNA。可见，山东省泰安地区恙虫病的流行可能存在多样性。从小家鼠中检测到Ot，提示也应做好泰安地区恙虫病疫区室内的防鼠、灭鼠工作。

同源性分析表明，泰安地区部分鼠类感染的Ot与Sdu-1型的核苷酸序列同源性最高，为99.77%；其次，与Taguchi和Oishi型的同源性均为95.98%，与Kanda和Kawasaki型的同源性均为95.74%；而部分鼠类感染的Ot与泰国的TA686型的同源性最高，分别为86.27% 和77.11%。系统发生树分析也显示，泰安地区部分鼠类感染的Ot与Sdu-1型在同一分支，亲缘关系极近，它们又与日本的Kawasaki、Kanda、Taguchi和Oishi型在同一分支，有很近的亲缘关系；而部分鼠类感染的Ot与泰国的TA686型在同一分支，亲缘关系最近。Sdu-1型分离于山东省临沂地区，是山东省秋冬型恙虫病流行型，与日本的Kawasaki、Taguchi、Oishi和Kanda型相似，而Kawasaki型又为这4种Ot型的代表[5]。可见，山东省泰安地区不仅存在与临沂地区相同的Ot基因型，该型与日本的Kawasaki型相似；同时还存在与泰国的TA686型相似的Ot基因型。山东省泰安地区是否已成为恙虫病的自然疫源地，有待进一步研究。

参考文献
[1] 杨玉富, 王均利, 姚允超, 等. 山东省首次发现恙虫病流行的调查[J]. 中华流行病学杂志, 1987, 8(5) : 280.
[2] 王均利, 刘长欣, 徐勤莲. 山东省恙虫病流行病学概况[J]. 中国人兽共患病杂志, 1996, 12(6) : 53–54.
[3] 单毓兰. 山东省新泰市发现恙虫病两例[J]. 中华流行病学杂志, 1991, 12(1) : 8.
[4] 汪昭旺, 刘文东, 李正奎, 等. 肥城市首次恙虫病暴发流行的调查分析[J]. 疾病监测, 2001, 16(8) : 307–308.
[5] 杨丽萍, 赵仲堂, 刘运喜, 等. 山东地区恙虫病东方体分离株的基因分型与序列分析[J]. 中华流行病学杂志, 2006, 27(12) : 49–52.
[6] 黄勇, 贾凤菊, 李玉民. 山东省恙虫病流行状况分析[J]. 地方病通报, 2003, 18(1) : 36–38.