甲基叔丁基醚(MTBE)为异丁烯和甲醇化合而成的无色透明液体,具有较强的挥发性。作为新型汽油添加剂，可提高汽油燃烧率，减少机动车辆尾气CO及其他有害物质的排放，并替代四乙基铅作为汽油抗爆剂^[1]。研究表明，MTBE对动物不同组织、器官、系统具有一定的急、亚慢、慢性毒作用。MTBE对中枢神经系统具有明显的抑制毒性作用，但其作用机制尚不清楚。本实验用MTBE对大鼠进行急性染毒，观察MTBE对大脑皮质神经递质Fos蛋白、Na⁺，K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶、神经元、神经胶质细胞的影响，探讨MTBE对中枢神经系统的急性毒作用机制。

MTBE(湖南长岭煤油厂)，纯度为98.7%。I抗为兔抗鼠Fos、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体(美国Sigma公司)。II抗为生物化羊抗兔、小牛血清(北京中山生物有限公司)。生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC液)(美国Sigma公司)。Motic Images Advanced 3.2型图像分析系统(美国Motic公司)。恒低温切片机(美国Therdo electron 公司)。ATP酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；可见分光光度计WFJ2100型(上海尤尼柯仪器有限公司)；低温高速离心机KA-1000型(上海安亭科学仪器厂)。

成年SD大鼠(中南大学实验动物部)66只，体重180～220 g，雌雄各半，随机分为8组。MTBE染毒途径为原液腹腔注射，染毒浓度为700，1 050，1 400 mg/(kg·bw)3个实验组；1 050 mg/(kg·bw)MTBE染毒组按染毒后不同时间(0.5，1.0,2.0,4.0,8.0 h)设5个实验组，另设1个对照组，注射等量生理盐水。其中对照组和1.0,8.0 h组各12只，其余每组6只。

采用生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物法(ABC)在大鼠腹腔注射10%水合氯醛［0.2 ml/(50 g·bw)］处理，迅速开胸，经升主动脉灌注生理水50 ml后灌4%多聚甲醛(0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，pH=7.4) 150～200 ml。取小脑置于上述固定液中固定2～4 h，再浸于15%和30%蔗糖磷酸缓冲液中至标本下沉。连续冠状冰冻切片，片厚30 μm。按免疫组织化学(ABC)法试剂盒方法进行操作。阴性对照采用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液代替一抗，其余步骤相同。判断标准为Fos蛋白定位于胞核，胞核染为棕黄色为阳性。

Nissl液配制：0.5 g焦油紫加50 ml双蒸水溶解后配成A液；1 g醋酸钠加50 ml双蒸水溶解后加1.5 ml冰醋酸配成B液；然后取B液450 ml加至A液后过滤即为1%Nissl液。染色主要过程如下：(1) 切片用0.01 mol/L PBS(pH-7.4) 漂洗3次，每次5 min；(2) 贴片自然晾干；(3) 二甲苯浸泡10 min，2次；(4) 梯度酒精(100%，95%，85%，70%)各5 min；(5) 1%Nissl液染色；镜下观察至背景几乎无染色，而神经元染色界限清晰；(6) 自来水冲洗后，梯度酒精(70%，85%，95%，100%)各5 min，其中100%酒精2次；(7) 二甲苯浸泡10 min，2次；(8) 中性树胶封片观察。

每只大鼠各取8张染色切片，每个部位取2张切片，在相同条件下，用Images Advanced 3.2图像采集系统采集图像并进行分析，测定观察部位的灰度平均值(灰度即图像的深浅程度，系统数字化图像的范围为0～255。阳性反应产物越深，灰度值越小，而相对灰度越大)。各组之间取同侧相同部位的相对灰度平均值进行比较。

各组大鼠脱臼处死，冰上取出脑组织并分离大脑皮质，将大脑皮质放入预冷(4℃)的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸擦干，称取约0.5 g大脑皮质用于匀浆。考马斯亮兰法测定脑皮质蛋白含量，应用分光光度法测定Na⁺，K⁺ -ATP酶、Ca²⁺ -ATP酶，脑皮质与反应液体积比为1:2，总体积200 μl，37℃下酶反应30 min，冷却至室温，3 000～4 000 r/min离心10 min，取上清液200 μl定磷。酶活力单位以每小时每毫克组织蛋白(mgprot)产生的无机磷(Pi)含量(μmol)来表示，即μmol pi/(mg prot.h)。

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。各组比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

表 1

表 1 不同剂量MTBE对大脑皮质Fos蛋白的影响(n= 6, 相对灰度值,x ± s)

表 1 不同剂量MTBE对大脑皮质Fos蛋白的影响(n= 6, 相对灰度值,x ± s)

免疫组织化学结果显示：随着MTBE浓度的增加，Fos蛋白相对灰度平均值逐渐升高，与对照组比较差异有统计学意义。

表 2

表 2 不同MTBE染毒时间对大脑皮质Fos蛋白影响(n= 6, 相对灰度值,x ± s)

表 2 不同MTBE染毒时间对大脑皮质Fos蛋白影响(n= 6, 相对灰度值,x ± s)

SD大鼠经MTBE 1 050mg/(kg·bw)染毒后不同时间大脑皮质Fos蛋白结果显示：染毒后0.5 h Fos蛋白表达即刻增强，其阳性神经元明显增多，胞核着色加深，相对灰度平均值增高；染毒后1.0 h达到高峰，Fos阳性神经元表达最多，胞核着色最深，相对灰度平均值最大；随后在染毒后2.0 h时Fos阳性神经元减少，胞核着色变浅，相对灰度平均值变小，至染毒后8.0h Fos蛋白的表达降至正常水平(图 1) 。MTBE染毒后0.5～4.0 h与对照组比较，Fos蛋白含量相对灰度平均值差异有统计学意义(P＜0.01) ，染毒后8.0 h与对照组比较，Fos蛋白含量相对灰度平均值差异无统计学意义(P＞0.05) 。

图 1

注: A: oh ; B: 0.5 h; C: 1.0 h; D: 2.0 h; E: 4.0 h; F: 8.0 h。 图 1 MTBE 染毒后不同时间对大脑皮质Fos 蛋白的影响( × 400)

表 3

表 3 MTBE染毒后不同时间对大脑皮质Na+，K+-ATP、Ca2+-ATP酶活性影响［(n= 6,x ± s,μmol pi/ ( mg prot. h))］

表 3 MTBE染毒后不同时间对大脑皮质Na+，K+-ATP、Ca2+-ATP酶活性影响［(n= 6,x ± s,μmol pi/ ( mg prot. h))］

大鼠经MTBE 1 050 mg/(kg·bw)染毒后，不同时间大脑皮质中ATP酶活性测定结果表明：染毒后1.0 h脑皮质中Na⁺，K⁺-ATP、Ca²⁺-ATP酶活性与对照组比较明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05) 。染毒后8.0 h脑皮质中Na⁺，K⁺-ATP、Ca²⁺-ATP酶活性恢复到正常水平，与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05) 。

光镜下，尼氏染色正常对照组神经元呈梭形、多边形、三角形等，细胞居中，尼氏小体分布在胞浆和树突内，呈监色板块状，多而清晰。MTBE染毒剂量1 050 mg/(kg·bw)染毒后1.0 h，大脑皮质神经元无核固缩、胞体无缩小变形、胞质内尼氏小体未见消失等形态结构的改变；免疫组织化学方法观察大脑皮质神经胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)，特异性反映星形胶质细胞形态结构改变。结果表明，正常对照组星形胶质细胞的突起细长，分支少表面光滑，核小呈卵圆形，染色质稀少。MTBE染毒剂量1 050 mg/(kg·bw)染毒后1.0 h，大脑皮质星形胶质细胞的突起无变粗、变短，细胞核形态无变形等病理性改变。

研究表明，MTBE对机体多系统具有急慢性毒作用^[2-4]。个体接触低浓度MTBE出现头痛、眩晕、恶心等现象。大鼠吸入MTBE染毒后可出现瞳孔变小，运动失调、鸭状步、后肢握力下降等表现，严重急性中毒者出现死亡，说明MTBE具有神经毒性^[5-10]。

Fos蛋白是c-fos基因的表达产物，是目前较为理想的脑功能活动的定位标记物^[11]。本实验结果显示，MTBE能诱导中枢神经系统大脑皮质神经元c-fos基因表达增强，导致Fos蛋白阳性产物增多。提示MTBE可毒作用于大脑，使大脑功能发生变化，且其毒作用具有剂量-效应和时间-效应关系。

在中枢神经系统中，脑组织细胞膜上富含较高活性的Na⁺,K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶^[12]。本实验根据MTBE对Fos蛋白影响的2个典型时间(1.0，8.0 h)检测其对Na⁺，K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶的影响。结果表明，MTBE对Na⁺，K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶的作用与MTBE对Fos蛋白影响相平行。结果提示，MTBE可毒作用于大脑这一靶部位，通过降低大脑Na⁺，K⁺-ATP酶、Ca²⁺-ATP酶，影响神经细胞能量代谢、扰乱细胞内Na⁺，K⁺，Ca²⁺离子稳态从而影响神经递质的释放和兴奋性信息的传递，发挥其毒作用。

本研究表明，MTBE急性中毒时MTBE可毒作用于大脑，改变神经细胞的能量代谢，从而影响神经系统的功能，但不影响神经元和神经胶质细胞的形态结构。