幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是上消化道疾病的主要致病菌，人群感染率在50%以上。感染呈全球性分布,其分泌的空泡毒素(VacA)在Hp致病过程中起重要作用。研究显示，硒作为一种人体必需微量元素，具有广泛的生物学活性^[1]，在预防克山病和某些癌症以及延续衰老中发挥着重要作用。本文研究硒对Hp VacA及重组VacA的影响，进一步探讨硒的作用，为硒产品的开发及Hp感染的诊治提供实验方法及理论依据。

（1）细胞株与菌株：SGC-7901细胞株（吉林省肿瘤研究所）；pET32a-vacA-E.coli BL21(DE3) 工程菌株（浙江大学微生物教研室严杰教授惠赠）；Hp（NCTC11637）标准菌株（中国预防医学科学院流病研究所）。（2）主要试剂：Ni-TEDTM（美国Activemotif公司）；哥伦比亚琼脂及气体发生袋（中国预防医学科学院流病研究所）；RPMI1640培养粉（美国Life Technologies公司）；亚硒酸钠（Na2SeO3·5H2O；沈阳市试剂五厂）。

(1) Hp培养：将Hp标准菌株等量接种于含15%胎牛血清牛脑心浸液中(含硒量分别为0,1,6,12,18,24 mmol/L)，37℃微需氧振摇培养3 d后，721型分光光度计测各管菌液吸光度（A）值，革兰染色观察菌体形状，透射电镜观察Hp结构改变。(2) VacA提取及纯化:将培养液12 000 r/min离心15 min,上清即为粗提VacA。用半饱和硫酸铵（25℃硫酸铵50%饱和度为313 g/L）于4℃沉淀2次，沉淀物以磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析过夜。将此提纯的VacA过Sephade× G200柱(30 cm×1.0 cm)，收集具有VacA活性的色谱峰，聚乙二醇(PEG)浓缩，0.22 μm滤膜抽滤,-20℃保存备用。

BL21(DE3) 工程菌株培养及重组VacA表达、提取、纯化及抗原性鉴定按参考文献^{[2, 3]}。

取装有10 ml质脂双层(LB，含氨苄青霉素100 mg/L)液体培养基的大试管，接种单个质粒阳性的大肠埃希菌落，150 r/min，37℃振摇培养过夜。取6支大试管，每支内加入灭菌LB培养液9 ml(含氨苄青霉素100 mg/L)，各加入上述培养过夜的菌液1 ml,再加入硒液，使各管硒的终浓度分别为0,1,6,12,18,24 mmol/L；150 r/min，37℃振摇培养，连续测菌液吸光度（A）值，观察硒对大肠埃希菌生长的影响。

（1）SGC-7901细胞复苏、培养、传代和冻存按参考文献^[4]方法。（2）硒对2种VacA细胞毒性作用影响：取对数期的SGC-7901细胞5×10⁴个/ml培养24 h，将纯化的二种VacA经0.22 μm滤膜抽滤后，各取0，50，100，200 μl平行加至细胞培养瓶中，另2组同样处理的培养细胞内分别加入亚硒酸钠溶液,使其终浓度分别为0，1，6，12，18，24 μmol/L，再取一组至对数生长期细胞，细胞内只加入同等上述量的硒溶液，留一组细胞做空白对照；37℃ CO₂培养箱内与细胞共同培养12，24，48，72 h,倒置显微镜下连续观察细胞生长状态并照像。培养3 d后的所有细胞，分别用胰酶消化制成单个细胞，2 000 r/min离心10 min，制成紧密的细胞团；2.5%戊二醛前固定,1%锇酸后固定,乙醇系列脱水,Epon 812环氧树脂包埋；LKB-III型超薄切片机定位后做超薄切片；醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色,JEM-120EX型透射电子显微镜观察、摄片。同时将连续培养3 d的细胞依次制成5×10⁶/ml细胞悬液，用PBS洗2次，加入5 ml 70%乙醇混匀；4℃固定24h后，测试前1 000 r/min离心5min,去除乙醇；PBS洗2次，用PBS制成1ml细胞悬液，加入RNA酶,使其终浓度为50 mg/L；37℃水浴消化1 h，再加入碘化丙啶（PI）使其终浓度为50 mg/L；避光4℃染色30 min，200目网筛滤过,进行流式细胞仪检测分析。

培养3 d后，Hp菌液浊度经721型分光光度计检测显示,随着硒浓度的增加而浊度减低，革兰染色观察发现，从硒含量在0～6 mmol/L管内细菌呈典型弧形，12 mmol/L管内细菌有个别呈圆球形，18及24 mmol/L管内的细菌则多数呈现出球形变，革兰染色不典型。透射电镜显示,球形变细菌鞭毛消失，但菌膜完整。VacA提取量亦随着硒含量的增加而减少(图 1～3) 。

图 1

图 1 无硒培养Hp

图 2

图 2 12 mmol/ L 硒培养Hp

图 3

图 3 18 mmol/ L 硒培养Hp

BL21(DE3) 工程菌株生长影响(表 1)

表 1

表 1 硒对pET32a-vacA-E.coli工程菌生长影响[吸光度(A) 值]

表 1 硒对pET32a-vacA-E.coli工程菌生长影响[吸光度(A) 值]

加硒培养工程菌，产砖红色色素。经LB固体培养结果表明，该色素为脂溶性，局限于菌落而不向四周扩散，并随着硒浓度增加颜色逐渐加深。721型分光光度计检测显示，工程菌生长随硒浓度增加受抑制。表 1可见，细菌培养4 h后，低浓度的硒（1，6 mmol/L）可促进E.coli工程菌生长（P＜0.05）；随着硒浓度的增加，工程菌生长抑制明显,6 mmol/L浓度的加硒组与无硒组比较,细菌A值差异无统计学意义(P＞0.05) 。12，18，24 mmol/L加硒组细菌生长A值与无硒组比较，差异有统计学意义（均P＜0.01）。

Hp提取VacA作用于SGC-7901细胞，6 h后即出现比较小的空泡，随着培养时间延长，越来越多的SGC-7901细胞呈现空泡样变，而且空泡数目逐渐增多，体积逐渐增大；1 d后呈强毒性作用，但SGC-7901细胞多数仍能贴壁生长，2 d后部分细胞开始逐渐体积膨胀死亡，漂浮于培养液中，经3 d培养后,多数细胞死亡；而未加空泡毒素的阴性对照培养细胞生长状态良好，连续培养4 d细胞形态未见明显改变。

将加硒培养Hp提取VacA细胞毒致空泡样变分为：低于40%细胞空泡样变定为阴性（-），40%以上为阳性（+），其中75%为++，90%为+++，100%为++++。结果发现，随着硒浓度的增加，细胞空泡变作用减弱。为了解这种减弱是因硒抑制Hp生长而使VacA产量减少，还是由于硒可直接抑制VacA空泡毒作用，采取无硒培养Hp提取空泡毒素，再与硒作用。结果显示，细胞空泡样变的规律与前述结果基本相同，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明硒对VacA空泡毒作用无影响。

与无硒组比较,硒能促进重组VacA对SGC-7901细胞的凋亡作用及其生长抑制作用。倒置显微镜观察显示,细胞生长进一步受到抑制,细胞空化更为明显，核固缩、胞质内基质及细胞器均呈空化状改变（图 4，5）。

图 4

图 4 正常SGC- 7901 细胞

图 5

图 5 24μmol/ L 硒及200μl 重组VacA 作用SGC- 7901 细胞

Hp感染是许多慢性胃病发生、发展中的一个重要致病因子，WHO已将其列为I类致癌原。Hp感染后，有的会发展为胃癌，而有的却发展为消化性溃疡。LeonBR,等^[5]认为这2种结局与地域相关的一些营养素作用有关，会影响Hp感染性早期慢性活动性胃炎向萎缩性胃炎的转化。这些因素包括有抗氧化作用的微量元素硒以及维生素C等^[6]。Yücelüstündag等^[1]研究发现，胃窦炎患者其胃窦组织硒水平与Hp感染有关,而与血浆硒水平无关。胃窦组织中硒水平升高是为了抵抗由于Hp 感染而增加的活性氧。邵世和等^[7]研究表明，一定浓度的亚硒酸钠可增强小鼠胃粘膜CD4细胞活性，使CD4/CD8比例上调，从而提高机体的细胞免疫和体液免疫，对Hp 引起的胃黏膜损害起到保护作用。本文研究表明，硒通过抑制幽门螺杆菌生长从而抑制了空泡毒素的产量，其抑制的机制尚待进一步研究。硒不能改变VacA的空泡活性。硒通过抑制pET32a-vacA-E.coli BL21(DE3) 工程菌生长从而减少重组VacA的表达产量，硒能促进重组VacA诱导SGC-7901细胞的凋亡作用及其生长抑制作用。其具体作用机制尚待研究。