大肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的健康与生命，降低大肠癌的发生率和死亡率一直是国际上研究的热点。随着化学预防这一新的防癌途径的出现，大肠癌的化学预防也越来越受到人们的重视。本研究应用二甲基肼(DMH)诱发的大鼠大肠癌动物模型，选用一系列生物学标志物，观察绿茶对大鼠大肠癌的化学预防作用，并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

雄性断乳Wistar大鼠(清洁级，合格证号：医动字第01-3008号)(中国医学科学院动物中心)。饲以动物中心提供的常备饲料。

1.1.2 试剂

绿茶(品牌：杭州炒青)由中国农业科学院茶科所提供；二甲基肼(DMH)(美国Sigma公司)；鼠抗大鼠增殖细胞核抗原(PCNA)抗体(美国ZYMED公司)；兔bcl-2抗体和兔bax抗体(美国Santa Cruz公司)；碱性磷酸酶标记二抗(美国VECTOR公司)。

1.2 方法 1.2.1 动物分组与处理

60只大鼠，平均体重69.5 g。在动物房适应1周后，随机分为3组：阳性对照组、绿茶水组和阴性对照组，每组20只。阳性对照组从实验第2周开始颈部皮下注射二甲基肼(DMH)，20 mg/kg·bw)，每周1次，连续10周。绿茶组处理同阳性对照组，并在整个实验期间自由饮用2%绿茶水，茶水每天新鲜配制，直至实验结束。阴性对照组颈部皮下注射相同剂量的生理盐水。阳性对照组和阴性对照组在整个实验期间自由饮用自来水。整个实验期间，每天观察动物一般情况，记录各组大鼠饮水或饮茶量。注射DMH期间每周称1次体重以调整DMH注射量。于实验第32周断头处死大鼠，取出大肠组织进行指标测定。

1.2.2 大肠肿瘤发生情况判定

处死大鼠后，迅速打开腹腔，分离出整根大肠，纵向剖开，用生理盐水冲洗肠内容物，展开铺于玻璃板上，观察每只大鼠大肠肿瘤发生情况。除计算肿瘤数目外，还用游标卡尺测量每个肿瘤的长、宽、高，计算瘤体积(mm³) 。

1.2.3 增殖细胞核抗原(PCNA)分析

PCNA测定用免疫组化法。用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作为阴性对照。PCNA阳性细胞为细胞核染成棕黄色，判定标准为每张切片在高倍光学显微镜下选有代表性的10个隐窝，记录其视野中细胞的PCNA阳性细胞数，计算其标记指数(LI)，标记指数以每100个细胞中的PCNA阳性细胞数表示。

1.2.4 核仁组成区嗜银蛋白颗粒(AgNORs)分析

石蜡切片常规脱蜡，梯度酒精水化，将明胶溶于1%的甲酸中，浓度为2%，再与50%的硝酸银按1:2的比例混合。在室温下避光染色60 min，终止染色后，梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片。每张切片在油镜下选有代表性的10个隐窝，每个隐窝计数20个细胞，测量指标为每个细胞核的平均每核AgNORs颗粒数目。

1.2.5 Bcl-2和Bax分析

B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2) 和B细胞淋巴瘤-2相关蛋白(Bax)分析方法同PCNA测定。Bcl-2和(Bax)阳性细胞为细胞膜、细胞浆或核膜染成棕黄色。判定标准为每张切片在光学显微镜下选有代表性的10个隐窝，根据隐窝中细胞的Bcl-2和Bax阳性细胞数占总细胞数的比例按4分位进行阳性分级：0%～25%为I级；26%～50%为II级；51%～75%为III级；76%～100%为Ⅳ级。

1.3 统计分析

采用方差分析和t检验比较各组瘤数目、瘤体积、PCNA阳性细胞数和AgNORs颗粒数目。应用Wilcoxon检验分析各组Bcl-2和Bax阳性细胞数。

2 结果 2.1 大鼠大肠肿瘤发生情况(表 1)

阳性对照组的全部大鼠均发生了肿瘤，平均瘤数目和平均瘤体积分别为2.55个/只和294.69 mm³，而阴性对照组动物无肿瘤发生。与阳性对照组比较，绿茶组动物的平均瘤数目减少了47.06%，平均瘤体积减少了77.09%。

2.2 大肠粘膜组织PCNA标记指数和AgNORs颗粒数目(表 2)

阳性对照组的PCNA标记指数和每核AgNORs颗粒数目显著高于阴性对照组。与阳性对照组比，饮用绿茶后，PCNA标记指数和AgNORs颗粒数均显著降低。

2.3 大肠粘膜组织Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达(表 3)

Bcl-2和Bax蛋白在阴性对照组均低表达，与阳性对照比较，饮茶32周后Bcl-2的表达显著降低，而Bax的表达显者增加。

3 讨论

茶叶是一种被人们广泛接受的饮品，流行病学资料显示饮茶与大肠肿瘤的发生具有相关性。^[1]本研究结果表明，给大鼠饮用2%绿茶水显著抑制了大肠肿瘤的发生，表现为平均瘤数目平均瘤体积显著减少。

近年来，PCNA和AgNORs作为生物学标志物被广泛应用于大肠癌的化学预防研究中^[2]。本研究中，给大鼠饮用2%绿茶水32周后显著降低了PCNA标记指数和AgNORs颗粒数目。

细胞凋亡的触发是一个多基因表达的结果，bcl-2癌基因就是众多调控基因中研究最深入的一种。研究表明，bcl-2基因家族的成员通常以二聚体的形式发挥作用，Bcl-2与Bax形成异二聚体，抑制细胞凋亡；Bax本身可形成同二聚体，促进细胞凋亡^[3]。本研究发现，与阳性对照组比较，饮茶抑制了Bcl-2蛋白的表达，诱导了Bax蛋白的表达，说明绿茶对细胞凋亡具有诱导作用。