产超广谱β-内酰胺酶（ ESBLs ）和头孢菌素酶（AmpC）细菌日益引起重视^[1-5]。产生 ESBLs 和 AmpC 酶是大肠埃希菌（E.coli）和肺炎克雷伯菌（K.pneu）对头孢类抗生素耐药的主要机制，并且在各地区流行的基因型不尽相同^[2-5]。为了解江苏省镇江地区分离的E.coli和K.pneu的耐药特性、ESBLs和AmpC酶基因型分布以及细菌间耐药性转移方式，进行了本研究。结果报告如下。

2005年1月～2006年6月，从本地区3家综合性医院住院和门诊患者标本中分离的产ESBLs和（或）AmpC酶的大肠埃希菌（E.coli）74株，肺炎克雷伯菌（K.pneu）35株。质控菌株：E.coli ATCC25922（浙江杭州天和微生物试剂有限公司）；K.pneu ATCC700603，产TEM-5，CTX-M-3，OXA-4型ESBLs的E.coli以及产MIR-1型AmpC酶的K.pneu（南京军区南京总医院邵海枫教授惠赠）。

17种抗生素药敏纸片、培养基(英国Oxoid公司);聚合酶链反应(PCR)试剂盒及100bpDNA分子量标准、琼脂糖等（日本TaKaRa公司）；根据GeneBank公布的ESBLs基因序列设计9对PCR引物；扩增ampC基因的PCR引物参照文献^[6]，由宝生物工程（大连）有限公司合成。

Hettich-UNIVERSAL16R型低温高速离心机(德国Hettich公司)；Mastercycler Personal 5332型PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)；国产BS 423型电泳仪(北京生化仪器厂)；国产MD-300型紫外多功能分析仪(镇江美达生物仪器有限公司)。

细菌药敏试验采用K-B法，操作及结果判断参考美国国家临床实验室标准(NCCLS)2004年标准；产ESBLs菌株表型确诊试验参照文献^[7]方法进行；AmpC酶检测采用文献^[8]方法。

ESBLs基因扩增体系：10×Buffer 2.5 μl、MgCl(1.5 mmol/L)1.5 μl、dNTP(0.2 mmol/L)2.0 μl、Taq聚合酶1.25 U、引物各10 pmo1、模板DNA（煮沸法制备）3 μl，添加灭菌去离子水至总体积25 μl；ESBLs基因扩增条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 1 min，退火1 min（退火温度根据引物而定），延伸72℃ 2 min，35个循环，最后72℃延伸10 min；ampC基因检测参照文献^[6]，采用多重PCR法进行。PCR产物用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳后，溴乙啶染色，在紫外线下观察产物片段。

以产生ESBLs和（或）AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌作为供体菌，E.coli-C600作为受体菌，进行转质粒试验。操作参照文献^[9]进行。

选择肠道菌广泛存在的菌体DNA中的重复序列ERIC-2(5＇AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G3＇)作为引物。ERIC-PCR扩增体系：10×Buffer 2.5 μl、MgCl(2.5 mmol/L)2.5 μl、dNTP(0.2 mmol/L)2.0 μl、TaqPolymerase 2U、引物各25 pmol、模板DNA（煮沸法制备）3 μl，添加灭菌去离子水至25 μl；扩增条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 1 min，退火35℃ 1 min，延伸72℃ 2 min，48个循环，最后72℃延伸10 min。产物用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳后，溴乙啶染色，在紫外线下观察。

产酶菌株对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、头孢吡肟的敏感性较高，对其他13种抗生素的耐药性较强（表 1）。

表 1

表 1 产ESBLs和AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对17种抗生素耐药率(%)

表 1 产ESBLs和AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对17种抗生素耐药率(%)

结果(图 1,2)

经PCR 扩增,发现ESBLs 以CTX-M 型检出率最高,占75.2 %(82/ 109) ,其次为TEM 型,占 35.8 %(39/ 109) ;AmpC 酶则以CIT 和DHA 型为主。

图 1

注：1，15：分别为蒸馏水和ATCC 25922对照；2～8：VEB-1、OXA-2G、OXA-1G、CTX-M-9G、CTX-M-1G、SHV、TEM型ESBLs阳性分离菌；9～14：OXA-2G、OXA-1G、CTX-M-9G、CTX-M-1G、SHV、TEM型ESBLs接合子；M：100bp分子量标准。 图 1 PCR扩增ESBLs 基因结果

图 2

注:1 ,3 分别为DHA 型和CIT 型ampC 基因阳性分离菌;2 ,4 为DHA型和CIT 型ampC 基因接合子;5 :MIR - 1 型ampC 基因阳性对照菌; 6 :ATCC25922 对照;M:100bp 分子量标准。 图 2 PCR圹增ampC基因结果

将产生ESBLs和(或)AmpC酶的74株大肠埃希菌和35株肺炎克雷伯菌分别与E.coli-C600进行接合试验，结果共有74株接合成功并能扩增出与供体菌相同的耐药基因片段，阳性率为67.9%。

74株E.coli和35株K.pneu均能扩增出清晰的DNA指纹图谱，扩增出的条带多在3～9条左右，大小多在200～1 500bp。

根据扩增片段数目、大小，将74株E.coli分成42型，其中11个型别分别含2株菌，6个型别分别含3株菌，3个型别分别含4株菌，22株菌各属1型。将35株K.pneu分成22型，其中6个型别分别含2株菌，2个型别分别含3株菌，1个型别含4株菌，13株菌各属1型。

图 3

注:M:100bp 分子量标准;1 与2 ,9 与12 ,10 与11 ,15 与17 带型相同;13 、14 、16 带型相同;3 ,5 ,6 ,7 带型相同;其他带型不同,提示有散 在克隆流行 图 3 ERIC- PCR分型结果

产ESBLs菌已在世界范围内广泛流行。国内以CTX-M和SHV为主要基因型，不同亚型的酶也呈区域性分布^{[4, 5, 10, 11]}。本研究发现，本地区E.coli和K.pneu产生的ESBLs以CTX-M型最为常见，占75.2%；TEM型酶检出率为35.8%；SHV型酶则主要由K.pneu产生。所产AmpC酶则以CIT和DHA型为主。本次研究中，有14株产酶菌未能检出相关的耐药基因型，这些细菌可能产其他类型的β-内酰胺酶或存在其他耐药机制。有46.8%的菌株同时携带至少2种以上耐药基因。药敏试验结果显示，产酶菌株对头孢噻肟的耐药率高达90.8%，结合CTX-M型ESBLs的高检出率，分析其主要原因与临床头孢噻肟的高使用率有关。研究显示，产酶菌对β-内酰胺类、喹诺酮类和庆大霉素等存在不同程度的耐药，但对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、头孢吡肟耐药性较低。因此，临床应根据细菌药敏试验选用合适的抗生素进行治疗。进一步的接合试验证实，由质粒编码的ESBLs和AmpC酶已在本地区的E.coli和K.pneu中出现。临床实验室应增加耐药酶及耐药基因的检测，加强医院内的消毒隔离措施，防止细菌的耐药质粒在不同细菌间转移而造成新的耐药菌株的出现。

随机扩增多态性聚合酶链反应(RAPD-PCR)，即ERIC-PCR技术采用肠道杆菌普遍存在的多拷贝重复片段作为引物，通过DNA扩增，产生基因指纹图谱，具有快速、简便、价廉、技术上对大多实验室可行的优点。本研究通过RAPD-PCR将74株E.coli分成42型，将35株K.pneu分成22型。结果表明,在本地区存在多克隆菌株的流行。