冠心病是危害人类生命健康的世界性公共卫生问题之一，严重影响着人类的期望寿命和生存质量。细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）由于介导了白细胞与受损内皮细胞的粘附，在冠状动脉粥样硬化发病机制中扮演着重要角色；而ICAM-1基因K469E多态性可引起氨基酸发生替代改变，这一改变有可能影响其血浆水平及其活性^[1]。为了解ICAM-1基因K469E多态性与冠心病的关系进行了本研究。结果报告如下。

选择2002年6月～2004年9月在山东省济南市中心医院住院的心绞痛患者71例，其中男性43例，女性28例，平均年龄（64±6）岁。病例诊断符合WHO的诊断标准^[2]，同时选择性冠状动脉造影术证实冠状动脉病变存在。选择同期入院，经检查左室功能、血清酶学及冠脉造影均正常，非冠心病患者164例作为对照组，其中男性94例、女性70例，平均年龄（65.76±6.38）岁。2组均排除伴有感染、肿瘤、糖尿病、全身免疫性疾病、严重肝肾疾病等。

采集空腹静脉血5 ml，2%乙二胺四乙酸（EDTA，含0.7%NaCl）抗凝；分离淋巴细胞，使用细胞裂解液裂解和蛋白酶K 消化后，采用标准酚-氯仿法提取基因组DNA。

参考文献[3]合成引物2对，S1:5＇-CCCCGACTGGACGAGAGG-3＇，S2:5＇-GGGGCTGTGGGGAGGATA-3＇；S-t：5＇-CACATTCACGGTCACCTT-3＇，S-c：5＇-CACATTCACGGTCACCTC-3＇。引物S-t/S-c根据研究位点突变的等位基因设计，由上海生工生物工程技术有限公司合成。

采用巢式PCR方法：(1) 第1次PCR:总反应体系为25 μl：25 ng DNA 模板、dNTP（上海博亚生物技术有限公司) 各0.2 mmol/L，2.0 U TaqDNA聚合酶（TakaRa宝生物工程（大连）有限公司），上下游引物（S1、S2）各15 pmol/L；循环参数：95℃预变性10 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，循环35 次,72 ℃再延伸7 min，产物长度为331 bp。(2) 第2次PCR：确定细胞间黏附分子-1(ICAM1) 等位基因。将首次PCR 产物按1:50稀释后作为2次PCR反应的模板，分A、B2管分别加入上下游引物（S1、S-t/S-c）进行2次扩增；循环参数：95℃预变性10 min；95℃变性30 s，56℃退火5 s，72℃延伸30 s，循环14次,72 ℃再延伸7 min，产物长度237 bp。2次扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察确定基因型。

采用SPSS 10.0软件进行统计分析，基因型和等位基因频率采用直接计数法。计数资料比较采用χ²检验，均数比较用t检验,采用Logistic回归方法分析基因型与疾病的关系。

2组间年龄、性别、体质指数、收缩压、舒张压、总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。首次PCR扩增产物可见331 bp电泳带（图 1）；经2次等位基因特异性引物扩增后，产物为237 bp片段。A、B2管均出现237 bp电泳带，为杂合子EK基因型；仅A管或B管出现237bp电泳带，则为纯合子KK或EE基因型（图 2）。

图 1

注M: DNA 分子量标准; 1~ 5: 331 bp 电泳带。 图 1 首次PCR 产物电泳图

图 2

注: 1, 4: KK; 2, 5: KE; 3: EE。 图 2 ICAM- 1 不同基因型电泳图

冠心病(CHD)组和对照组基因型分布均符合哈德-温伯格平衡定律（Hardy-Weinberg Equilibrium），实际频数与理论频数之间相比差异无统计学意义(P＞0.05) ，基因型与等位基因的组间分布差异有统计学意义(P＞0.05) 。CHD组K469E基因KK型、KE型、EE型频率分别为39.4%，42.3%，18.3%,对照组分别为24.4%，39.6%，36.0%，2组比较差异有统计学意义(P＜0.011) 。CHD组K、E等位基因频率分别为59.7%和40.3%,对照组分别为44.2%和55.8%,2组比较差异有统计学意义(P＜0.001) （表 1）。

表 1

表 1 2组基因型实际频数与理论频数比较

表 1 2组基因型实际频数与理论频数比较

将有无心绞痛作为因变量，进行二元多因素Logistic回归分析。结果可见，K等位基因与是否患有心绞痛明显相关，K等位基因OR=2.507,95%CI=1.269～4.952(P=0.008) 。调整年龄、 性别、体质指数、收缩压、舒张压、总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白等其他危险因素后，依然存在相关性，K等位基因OR=2.525,95%CI=1.259～5.065（P=0.009）。

有研究显示，ICAM-1基因多态性与冠心病、心肌梗塞、脑卒中、外周动脉闭塞性疾病(PAOD)、神经退行性病变、心脏移植、炎性肠病、糖尿病等多种疾病呈相关性^[1]。但细胞间黏附分子-1（ICAM-1）基因多态性与冠心病之间的关系，国外研究结果不一。Jiang等^[4]对349例冠心病患者（含心肌梗塞）和213名对照ICAM-1 K469E基因多态性研究发现，基因型频率在CHD组为EE 18%，KE 42%，KK 40%,心肌梗死（MI）组为EE 21%，KE 44%，KK 35%，对照组为EE 41%，KE 31%，KK 28%，存在明显差异，与对照组比较，含等位基因K（基因型为KK和KE）的个体患CDH和MI的危险度明显升高，且差异有统计学意义（P＜0.001）。研究还发现，ICAM-1的KK/KE基因型与吸烟、高胆固醇血症均为CHD和MI的独立危险因素，且KK/KE基因型的发病率是EE基因型的3.32倍，95%CI=1.84～5.97。Borozdenkova等^[5]对心脏移植患者研究发现，E等位基因抑制ICAM-1与其配体LFA-1的结合，对于减少心脏移植后排异反应起一定作用。而Gaetani等^[6]研究发现，EE基因型在外周动脉阻塞性疾病中检出频率高于对照组。本文结果显示，细胞间黏附分子-1（ICAM-1）基因K469E多态性所致基因型KK、KE、EE在心绞痛和对照组的分布差异有统计学意义，K等位基因频率在冠心病组较高。采用Logistic回归分析调整混杂因素后，KK+KE基因型与心绞痛相关，KK＋KE基因型患有心绞痛危险性是EE型的2.525倍，提示等位基因K可能与心绞痛发作有关，可能是冠心病发病的独立危险因素。