中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (7): 795-797   PDF    
引用本文
黎银燕, 曾婉明, ChenHong, 曾波航, 王云南, 宾晓农, 纪卫东, 吕嘉春. 肺癌及癌前病变组织中P53基因突变蛋白检测[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(7): 795-797.
LI Yin-yan, ZENG Wan-ming, Chen Hong, et al. Detection of mutated protein of P53 gene in human lung precancerous lesions and lung cancer tissues[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(7): 795-797.
肺癌及癌前病变组织中P53基因突变蛋白检测
黎银燕1, 曾婉明1, ChenHong2, 曾波航1, 王云南3, 宾晓农1, 纪卫东1, 吕嘉春1     
1. 广州医学院化学致癌研究所, 广州 510182;
2. The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA;
3. 广州市胸科医院
收稿日期: 2008-03-11
基金项目: 国家自然科学基金(30200235,30671813);广东省自然科学基金(07003055,07003060)
作者简介: 黎银燕(1968- ),女,广西柳州人,实验师,本科,主要从事细胞生物学和遗传学的教学和科研工作。
通讯作者: 吕嘉春
摘要: 目的 探讨P53基因突变在肺癌癌前病变(支气管黏膜上皮不典型增生)和肺癌中的作用。 方法 在41例支气管黏膜上皮不典型增生组织、150例肺癌患者手术标本及51例正常肺组织中用免疫组化的方法检测P53基因突变蛋白的表达,并用PCR扩增和DNA测序技术,检测P53基因在二羟环氧苯并芘(BPDE)诱导人气管上皮细胞系转化过程中的变化。 结果 7.8%(4/51)的正常肺组织中可检测到P53基因突变蛋白;43.9%(18/41)的支气管黏膜上皮不典型增生组织和68.7%(103/150)的肺癌组织中可检出P53突变蛋白,组间差异有统计学意义,P＜0.001。且随着肺组织癌变过程的变化,P53基因突变蛋白的表达呈逐渐增高的趋势,P＜0.001。吸烟者P53突变蛋白检出率高于非吸烟者。BPDE诱导人气管上皮细胞的转化细胞可同时检测到P53突变蛋白的表达及P53基因序列的突变。 结论 P53基因突变与肺组织癌变过程密切相关,吸烟暴露可导致P53基因的突变,检测P53突变将为肺癌的早期诊断提供科学依据。
关键词： 肺癌     癌前病变     P53基因     突变    
Detection of mutated protein of P53 gene in human lung precancerous lesions and lung cancer tissues
LI Yin-yan, ZENG Wan-ming, Chen Hong, et al     
The Insttute for Chemical Carcinogenesis, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182, China
Abstract: Objective To investigate the role of mutations of P53 gene in the atypical hyperplasia of bronchus epithelia and carcinogenesis of lung. Methods Immunohistochemistry staining was used to detect the expression of mutated P53 protein in 41 cases of bronchus epithelium tissues,150 cases of lung cancer tissues and 51 cases of normal lung tissues.PCR amplification and DNA sequencing were used to assay the mutaion of P53 gene in the BPDE transformed human bronchial epithelium cells. Results The expression rate of mutated P53 protein was 7.8% (4/51)in normal lung tissues,43.90% (18/41)in atypical hyperplasia of bronchus epithelium tissues,and 68.7% (103/150)in lung cancer tissues,the difference between different tissues was highly significant(P＜0.01),and there was a trend for expression of mutated P53 from normal lungs to atypical hyperplasia of bronchus eithelium,and to lung cancer(P＜0.001).The expression of mutated P53 were higher in the smokers than that of non-smokers.The mutated P53 protein and mutaion in the sequence of P53 gene were detected simultsneously in BPDE transformed human bronchial epithelium cells. Conclusion The mutation of P53 is associated with lung carcinogenesis,smoking exposure can cause P53 mutation,and the detection of mutation in P53 gene will be helpful for the early diagnosis of human lung cancer.
Key words: lung     neoplasm     precancerous lesion     P53     mutation    

Lane和Crawford于1979年发现了一种编码蛋白质为53KD的基因[1]，故命名为P53基因[1]，最初认为它是一种癌基因，随着研究的不断深入，发现P53是一种典型的抑癌基因[2]。P53蛋白作为一种细胞转录因子，具有多种重要的功能，如参与DNA修复、抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡等；野生型P53基因具有抑制肿瘤的作用[2]，但该基因发生突变后不但失去其抑癌功能，突变体还可促进细胞转化和增殖，表现出癌基因的功能。研究报道肺癌组织P53基因突变的检出率高达60%～80%[3]；Ruano-Ravina等[4]研究发现，检测P53突变蛋白及其突变谱有利于阐明肺癌的病因。本课题拟检测正常肺组织、肺癌前病变和肺癌组织中P53基因的突变状况，以阐明P53基因的突变在肺癌变过程中的作用。

1 材料与方法 1.1 标本来源

病例均来自广州医学院附属医院、广州市胸科医院2000～2003年的接诊病例，经纤支镜活检和手术留取标本，-70℃保存。每例组织经石蜡包埋、切片、常规苏木素-伊红(HE)染色，由2位临床病理学专家进行双盲病理学确诊。共收集首次手术诊断、未经治疗的原发性肺癌150例(鳞癌84例、腺癌46例、小细胞肺癌16例、其他4例)、肺癌癌前病变41例(支气管黏膜上皮细胞轻度、中度和重度不典型增生分别为15，11和15例)及51例正常肺组织标本。

1.2 P53突变蛋白的免疫组化检测

所用抗体为小鼠抗人P53基因单克隆抗体(1801) ［美国Sata Cruz公司(SC-99) ］。各种肺组织标本组织石蜡切片，切片经二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗。按迈新公司超敏试剂盒(KIT-9710) 使用说明书检测肺组中上述基因的表达，经二氨基联苯胺(DAB)显色，HE复染，封片。用PBS分别代替一抗、二抗作阴性对照。光镜下每张切片选较好的4个视野，计数400个细胞，P53阳性为细胞核着色。由于野生型P53蛋白的半衰期很短，通常难以检测，而突变型P53蛋白的半衰期较野生型P53蛋白的半衰期延长约20倍，在细胞核内聚积，用免疫组织化学方法检测到的P53蛋白通常为P53突变蛋白；Wang等的研突证实P53突变蛋白与P53基因之间有较好的关联性[5]。按半定量的方式对实验结果进行阅片，P53蛋白染色阳性细胞占全部细胞的百分比＞5%的标本为阳性结果，5%～15%为+(弱阳性)，16%～30%为++(中阳性)，＞30%为+++(强阳性)。

1.3 P53基因序列测定

利用本单位前期建立的苯并芘［B(a)P］代谢物二羟环氧苯并芘(BPDE) 诱导正常人气管上皮细胞系恶性转化的模型，按文献[7]方法，提取正常的人支气管上皮细胞系16HBE细胞、经BPDE染毒的转化前期细胞和转化细胞的DNA，通过PCR技术扩增P53基因的第5～8外显子片段，经序列测定以确定P53基因的突变位点；同时将各时期处理细胞涂片，用免疫组织化学方法检测P53突变蛋白，以评价P53基因突变蛋白表达与P53基因序列突变的关系。

1.4 统计分析

建立Excel数据库，应用SPSS 10.0和EpiInfo 6.0统计软件进行χ2检验，分析P53基因突变蛋白表达在不同组间的差异，用χ2趋势检验分析其变化趋势。

2 结果 2.1 P53基因突变蛋白在肺癌、肺癌前病变和正常肺组织中的表达(表 1)
表 1 P53基因突变蛋白在肺癌、肺癌前病变和正常肺组织中的表达

经统计学分析，3组间P53基因突变蛋白的阳性率差异有统计学意义(χ2=57.8,P＜0.001) ,且有随着肺组织癌变过程的变化，P53基因突变蛋白的表达呈逐渐增高的趋势(χ2趋势检验χrend2=56.9,Ptrend＜0.001) 。

2.2 P53基因突变蛋白表达与肺癌和肺癌前病变临床特征(表 2)
表 2 P53基因突变蛋白表达与肺癌临床特征的关系

150例肺癌组织中P53基因突变蛋白表达与肺癌患者性别、年龄、组织病理类型、临床分期、肿瘤分化及淋巴结转移无相关；但P53基因突变蛋白的阳性表达随着吸烟程度的增加呈逐渐增高的趋势(χrend2=16.8,Ptrend＜0.001) 。在41例肺癌前病变组织标本中，P53基因突变蛋白表达与患者的性别、年龄及不典型增生的分级程度无关，但吸烟者与不吸烟者P53蛋白阳性率之间的差异为显著性临界值(χ2=3.39，P=0.067) 。

2.3 B(a)P代谢物BPDE诱导人气管上皮细胞系恶性转化模型中P53基因突变的检测(图 1)

正常的人支气管上皮细胞系16HBE细胞其P53突变蛋白为阴性。经BPDE染毒的转化前期细胞(BPDE2.0 μmol/L染毒处理细胞至第20代)已可检出P53突变蛋白(弱阳性)；第30代转化细胞已可在软琼脂培养基上形成集落，即为恶性转化细胞；挑取集落细胞接种裸鼠，可形成肿瘤，经鉴定为鳞状上皮细胞癌，瘤组织经培养建立传代细胞。在恶性转化细胞和成瘤细胞中P53突变蛋白皆为强阳性。利用PCR和DNA序列测定，正常的16HBE细胞未见P53基因的序列异常，但在转化细胞和裸鼠成瘤细胞中，发现P53基因Exon6对应于人TP53mRNA(NM-000546.2) 第839～840位核苷酸之间插入了一个A，可使其后续的第197～224位氨基酸发生移码突变。同时还发现其P53基因Exon8的第282位密码子位置现了G→T点突变，其编码的氨基酸由精氨酸(CGG)→亮氨酸(CTG)，表明P53突变蛋白的检测与P53基因序列测定结果相吻合。

图 1 BPDE转化细胞P53 基因Exon8 测序结果

3 讨论

人类P53基因定位于染色体17p13.1，全长约为16～20 kb，cDNA长度为2～3 kb;包含11个外显子和10个内含子，编码393个氨基酸组成的蛋白质，分子量为53KD。由于通常情况下野生型P53蛋白在细胞内存在的半衰期极短，用免疫组织化学检测到的P53蛋白通常为P53突变蛋白。本课题发现肺癌和支气管黏膜上皮不典型增生组织中P53突变蛋白都高于正常肺组织，且在正常-癌前病变-肺癌之间呈逐渐增高的趋势。本研究结果与文献[8, 9]一致。本课题利用人气管上皮细胞转化模型发现细胞由正常到癌变过程中，P53突变蛋白存在阴性-弱阳性-强阳性的变化；P53突变蛋白的检测与P53基因序列测定的结果一致。进一步分析还发现，P53基因突变与患者的吸烟暴露有关。

本研究通过对正常肺组织-支气管黏膜上皮不典型增生-肺癌组织3个不同阶段中P53基因突变的比较，以及对B(a)P代谢物BPDE诱导的人气管上皮细胞系恶性转化模型进行动态研究，发现P53基因与肺组织癌变过程密切相关，吸烟暴露可导致P53基因的突变，检测P53突变将为研究肺癌变的机制和进行肺癌的早期临床诊断等提供分子生物学依据。

参考文献
[1] Lane DP, Crawford LV. T antigen is bound to a host protein in SV40-transformd cells[J]. Nature, 1979, 278(5701) : 261–263. DOI:10.1038/278261a0
[2] Baker SJ, Markowitz S, Fearon ER, et al. Suppression of human colorectal careinoma cell growth by wild-type P53[J]. Science, 1990, 249(4971) : 912–915. DOI:10.1126/science.2144057
[3] Harris CC, Hollstein M. Clinical implications of the P53 tumor-suppressor gene[J]. N Engl J Med, 1993, 329(18) : 1318–1327. DOI:10.1056/NEJM199310283291807
[4] Ruano-Ravina A, Perez-Becerra R, Fraga M, et al. Analysis of the relationship between p53 immunohistochemical expression and risk factors for lung cancer,with special emphasis on residential radon exposure[J]. Ann Oncol, 2008, 19(1) : 109–114.
[5] Wang Y, Dai SD, Qi FJ, et al. P53 protein expression and genetic mutation in two primary cell types in pulmonary sclerosing haemangioma[J]. J Clin Pathol, 2008, 61(2) : 192–196.
[6] 蒋国义, 陈家, 陈学敏. 苯并(a)芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘诱发人支气管上皮细胞恶性转化[J]. 卫生研究, 2001, 30(3) : 129–131.
[7] 纪卫东, 吴中亮, 陈家. 反式-BPDE 诱发人支气管上皮细胞系P53基因突变的研究[J]. 中国职业医学, 2001, 28(2) : 12–13.
[8] 申洪, 刘振邦, 张錾歆, 等. 支气管上皮增生病变FHIT 和P53 基因检测[J]. 诊断病理学杂志, 2007, 14(3) : 221–223.
[9] 李代强, 谢季, 李美蓉. 肺鳞癌及癌前病变PCNA、p16 、p21 、P53表达及细胞凋亡观察[J]. 临床与实验病理学杂志, 2002, 18(4) : 384–386.