铅具有很强的神经亲和性，可在神经组织中蓄积，引起神经系统功能（主要是学习记忆功能）的长期损害。己有实验证明，低浓度铅可引起蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）的异常激活；高浓度铅可引起PKC的异常抑制，但作为PKC的一个亚型，PKC-γ在小鼠脑组织中的表达变化情况尚未清楚。目前铅神经毒作用机制研究中的一重要内容就是探讨铅对中枢经神细胞信号传导过程中蛋白激酶功能的影响。本研究通过观察慢性醋酸铅染毒对小鼠海马中PKC中γ亚型（PKC-γ）蛋白表达的影响，探讨慢性铅中毒分子机制。

昆明系小白鼠（中国医科大学实验动物部），体重28～34 g。分析纯醋铅和硝酸纤维素膜（中国实验原平皓公司）。十二烷基磺酸钠（SDS）（华美生物技术公司）。牛血清白蛋白（联星生物工程公司）。PKC-γ抗（美国Santa Cruz公司）碱性磷酸酶（AP）标记马抗鼠第二抗体和碱性磷酸酶标记山羊抗兔第二抗体（北京中山生物技术有限公司进口分装）。低温离心机F-218型（美国Sigma 公司）。

（1）动物染毒及分组：按每笼雄：雌为1:2自然交配，将产下的幼鼠随机分为4组，每组成10只，共40只（对照组和2.4,4.8,9.6 mmol/L染铅组）。从小鼠出生第3 d起染铅组母鼠开始饮用不同浓度(2.4,4.8,9.6 mmol/L)醋酸铅水溶液。对照组母鼠饮用自来水。为确保相同的营养条件，每个母鼠最多喂养成10只胎鼠。断乳后幼鼠开始自己饮用与其母鼠相同的饮用水。于出生后第三者14，21，28，35d解剖小鼠，取出海马，放入液氮中，转存到-70℃冰箱中。（2）血铅：激铅测定：采用石墨炉原子吸收光谱法测定。（3）蛋白免疫印记法：将收集的样品放到4℃预冷的裂解缓冲液中，4℃超声混匀（6 s ,6次），4℃震荡60min，25000g离心60min,取血清分装。用酚试剂法测蛋白，以牛血清白蛋白为标准品。用10%的十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，每孔蛋白加样量为40 μg 。用磷酸化抗体，常规免疫印迹（Western blots ）法测定活化的PKC-γ含量。用蛋白印迹显影仪印描，再利用Chemi Imager 5500 V2103 图像分析软件对结果进行分析，灰度值代表酶含量。

采用SPSS11.0统计软件进行分析。

于小鼠出生后第28 d进行血铅和脑海马铅含量的测定，各慢性染铅组小鼠血铅和脑海马含量均高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05) ，升高的程度与饮用水的铅浓度呈正相关，见表 1。

表 1

表 1 小鼠血铅、海马铅浓度(x ± s, n= 10)

表 1 小鼠血铅、海马铅浓度(x ± s, n= 10)

将实验后的电泳图扫描后，以不同天数对照组的度值为100，其余各组与相应天数的对照组比较。结果发现，总体上慢性铅暴露对小鼠脑海马PKC-γ蛋白的表达有剂量依赖性关系及时间表达差异，见图 1，表 2。

图 1

图 1 慢性铅暴露对小鼠海马组织中PKC-γ蛋白表达的影响

表 2

表 2 慢性铅暴露对小鼠海马组织中PKC-γ蛋白表达的影响(x ± s, n= 10)

表 2 慢性铅暴露对小鼠海马组织中PKC-γ蛋白表达的影响(x ± s, n= 10)

海马是铅海损害的主要靶区^{[1, 2]}，是大脑学习和记忆的关键部位。海马长时程增强（Long Term Potentiation,LTP）由于本身具有协同性联合性、特异性待特点，使它成为信息储存和记忆的细胞机制^[3]。近年来研究表明，PKC与突触可塑性及LTP的形成密切相关^{[4, 5]}。本研究发现，不同浓度的铅对不同发育时段的PKC-γ表达有不同程度的激活或抑制。铅暴露小鼠脑皮质中PKC-γ表达波动与正常组基本相似，但差异较明显，多数组第21 d(P21) 为最高峰，随着铅浓度的升高，这些时段的PKC-γ表达逐渐降低，较高铅较度组酶表达均低于正常组。可能是铅可取代模拟Ca²⁺的作用，激活Ca²⁺通道并入细胞内。铅取代钙后可扰乱PKC的正常激活，使PKC后应敏感性下降，进而扰乱PKC在海马中的表达量^[6-8]。