风疹是由风疹病毒(rubella virus，RV)引起的急性呼吸道传染病。我国虽然已将其列入监测管理疾病，但风疹疫苗接种尚未列入计划免疫范畴。RV最严重的危害是经垂直传播导致胎儿先天性感染，未感染过RV的孕妇，以孕期3个月内感染RV对胎儿危害最大，可引起胎儿死亡或出生后表现为先天性心脏病、耳聋、白内障、智力发育低下等畸形，称为先天性风疹综合征（CRS）。近年来，优生优育日益受到重视，RV感染作为出生缺陷监测中的重要内容，需要较高水平的检测方法。现就RV检测方法研究进展综述如下。

1 病毒分离 1.1 病毒分离常用标本、细胞

分离常用的临床标本有咽拭子、外周血单核细胞、胚胎、羊水、血液、尿液、脑脊液等。常用的敏感细胞为BHK21、RK-13、Vero、HuEK、BSC-1、LLC-MK2、AGMK、HEK等。这些细胞分离病毒的周期较长，分离过程比较复杂。

1.2 分离方法

Zhao S等^{[1, 2]}分别将RV等10多种病毒各0.1 ml接种于Z-HL16C细胞,显微镜下观察病毒诱导Z-HL16C细胞的病变效应，接种后1 d各种病毒即可出现75%以上的细胞病变效应（CPE），明显节省了时间。Yan H等^[3]将人表皮样癌细胞的染色体DNA经提纯后转染到人胚肺细胞中建立起一种对弓形体、RV、巨细胞病毒及单纯疱疹病毒4种病毒敏感的遗传杂交细胞系；对这种称为D3的杂交细胞进行染色体核型分析显示其染色体数为96，经100次传代可稳定表达；显微镜及免疫荧光可观察到这4种病原体感染D3细胞所出现的明显CPE。将这4种病原体应用蔗糖梯度离心法提纯后作为抗原，检测怀疑感染这4种病原体的孕妇血清中的特异性IgG或IgM，其检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致，表明这种稳定的遗传杂交细胞系可以作为宫内传播病原体分离的有力工具，还可为血清学试验制备抗原。

虽然现在已有许多快速、准确、简便的病毒检测方法，但它们仍无法替代病毒分离的作用。RV传统的敏感细胞分离病毒的周期较长，CPE不明显，将逐渐被新研究出来的更为高效的细胞所取代。病毒的变异非常迅速，细胞培养可以分离出最新流行的病毒变异株，在病原学研究、诊断试剂的开发、药物与疫苗的研制方面有重大意义。

2 电镜技术

利用电子显微镜可直接观察病毒形态，可在感染早期标本中直接检出病毒颗粒，主要有超薄切片、负染、免疫电镜等技术。免疫电镜技术（immunoelectron microscopy，IEM）是在免疫组织化学技术（immunohistochemistry）的基础上发展起来的，利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量检测抗原的技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术3个主要发展阶段。胶体金是目前应用最广的免疫电镜标记物，主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变；（2）金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1～150nm）的胶体金，因此，可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。

3 免疫学检测 3.1 免疫荧光试验（fluorescen immunoassay，IFA）

IFA分为直接法和间接法，可检测病毒抗原或抗体。IFA方法敏感、特异，结果易于判断，是麻疹实验室网络中进行RV检测的重要方法之一。该法把免疫学的特异性、荧光色素的敏感性、显微镜检查法集为一体，扩大了免疫学诊断的效果，是近代免疫学的一种重要研究手段。朱贞等^[4]报道了将IFA法进行改进的比色法免疫学实验检测细胞培养液中的RV，该方法用辣根过氧化物酶取代荧光素标记羊抗鼠IgG抗体，并加入蓝色过氧化物酶(peroxidase,POD)，检测结果通过肉眼或普通显微镜即可观察。比色法检测咽拭子标本的阳性率为57.9%，这与同时进行的病毒分离和IFA检测结果完全一致，比色法免疫学实验与IFA的灵敏度相同,都为10 PFU/ml。特异性鉴定实验中,对除RV和麻疹病毒之外的其他出疹性病毒进行检测的结果都为阴性^[4]。比色法免疫学实验既可以保持IFA 的敏感、特异性的优点,而又弥补了IFA 需要昂贵的荧光显微镜的不足,只需在常规实验条件下而不借助特殊仪器就可以达到快速检测RV 感染的目的，更适合推广应用。

3.2 ELISA法 3.2.1 间接ELISA与捕捉ELISA

周俊等^[5]利用聚乙二醇(PEG)能加速抗原抗体反应，促使其沉淀的特点，在常规间接ELISA法的一抗和二抗中加入4％的PEG，以缩短反应时间，用该法测定39份风疹阳性血清的RV IgM 抗体，检出率为97.4%，与常规间接ELISA检测结果(92.3%)一致。183份阴性血清中95.1%的标本未检测到RV IgM 抗体，高于常规间接ELISA(87.5%)。Morris等^[6]在检测唾液中特异性IgG时发现，在样本中IgG浓度比较低时，捕捉ELISA比间接ELISA更为敏感。捕捉ELISA是目前最为常用的一种。Vyse AJ等^[7]报道它能检测血清样本中最少7 U/ml RV特异性IgG。将唾液样本分别用此法与放射免疫法（RIA）同时检测。结果发现，捕捉IgG- ELISA的灵敏度（82%）优于RIA（74%）。另外这种捕捉IgG-ELISA检测法特别适合检测10岁以下儿童的唾液样本，其灵敏度及特异度分别为94%和100% 。Akingbade等^[8]也用捕捉性IgG-ELISA测定唾液中的RV低亲和力IgG，其灵敏度与特异度分别为94%和88%。这种方法特别适合于筛查试验和儿童病毒感染的检测，唾液标本采集极为简单，无创伤，迅速、易于被病人接受，与IgM-ELISA检测联用可提高在IgM检测的阳性预测值低时的风疹筛检的可信度。

3.2.2 包被抗原的改进

目前常用病毒抗原作为包被抗原进行ELISA检测，但在生产病毒抗原时会使其含有细胞碎片和培养液，其灵敏度和特异度均受到影响。温红玲等^[9]将毕赤酵母表达的RV E1重组蛋白与病毒抗原分别作为包被抗原进行ELISA诊断实验，并用德国RICE试剂盒和进口分装试剂盒同时检测血清标本。4种结果测得的阳性率分别为84.44%，75.56%，61.11%，45.56%。该研究发现，重组抗原作为包被抗原其灵敏度、特异度及符合率均高于病毒抗原。此种方法操作简便，成本低，适合进行大规模生产，有广阔的应用前景。

3.2.3 ELISA与PCR检测的比较

Mosquera Mdel M等^[10]对 59名可能感染麻疹或风疹病人的血清、全血、尿液及咽拭子样本分别进行特异性IgM及RT-PCR检测。对咽拭子标本RT-PCR检测可在感染后的2.5 d就出现阳性结果，最为敏感，而特异性IgM的检测虽然能得到较高的阳性率，但在感染后的3.7 d才能检测出。随着分子生物学技术的发展，传统的血清学方法受到挑战，但PCR的检测技术、仪器等要求严格，不适合在不发达地区使用，ELISA法更适合用于大量样本的检测。

3.3 蛋白质芯片技术(protein microarray assay)

此技术近年来发展迅速，蛋白质芯片以微阵列方式将各种“捕获”分子固定在支持物上。识别并结合样本中的靶蛋白分子。多数蛋白质芯片为抗体芯片，即“捕获”分子为各种抗体。可识别样本中由染色剂标记的抗原蛋白。抗原抗体反应后，靶蛋白分子与芯片结合，通过收集芯片上的荧光信号，可在蛋白质水平了解样本的基因表达情况。但这项技术的应用要求严格，许多发展中国家和小型医院难以广泛应用。Li D等^[11]将快速斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)与蛋白质芯片技术相结合检测孕妇血清中的弓形虫、风疹、巨细胞、单纯疱疹(TORCH)相关病毒抗体，这种方法不需特殊仪器设备，检测结果肉眼即可观察。在研究中发现，基于DIGFA的蛋白质芯片在以下3个方面优于ELISA法：(1)省时；（2）ELISA能检测抗原的最低限为100～200 ng，而蛋白质芯片可达10～20 ng；（3）蛋白质芯片结果的观察无需任何特殊设备。缺点：检测精确度不如应用荧光扫描仪等设备的蛋白质芯片高，但对于产前诊断和流行病学筛检已经足够了。蛋白质芯片是目前较为快速的检测方法，灵敏度高于ELISA，如果成本能够逐步降低，会在将来有更广泛的应用。

4 核酸分子杂交

核酸分子杂交利用放射性核素或非放射性核素标记的已知特异性核酸片段作为探针，检测标本中与探针有相同序列的目的核酸，已广泛用于病毒的检测和研究。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。基因芯片(gene chips)以分子杂交技术为基础，以微点样技术在固体支持物上排列成高密度的微量探针矩阵。计算机扫描收集分子杂交信号，通过生物信息学分析，获得需要的信息。基因芯片具有高效率、低消耗、大通量、高精度以及能平行对照研究等特点。Liu Q等^[12]将多重PCR与基因芯片技术相结合，在同一反应体系中PCR与分子杂交反应相继进行，同时对4种呼吸道病毒进行检测，检测具有较高的灵敏度，因为设有内参照，所以这种方法无假阳性率和假阴性率，结果较为可靠。该方法检测的效率高，节省人力、物力，方便，避免了PCR产物的交叉污染，可用于多种病毒基因的同时检测。

5 PCR技术 5.1 巢式反转录PCR技术（nested reverse transcription polymerase chain reaction,nRT-PCR）

巢式PCR反应有2次PCR扩增，降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少），增加了检测的灵敏度；又有2对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。为了经济节约，可在第2轮扩增时采用半巢式，设计单条引物，另一条引物与第1轮扩增共用，效果也优于单次扩增。Mace M等^[13]应用反转录PCR法检测羊水中的RV RNA，检测的特异度为100%，灵敏度为83%～95%，可见RT-PCR可作为产前诊断风疹宫内感染的有力工具。Shyamala G等^[14]对30名患有先天性白内障婴儿的晶状体抽取物及相应外周血白细胞进行巢式反转录PCR检测(其中先天性白内障29例,后天性1例)，可检测样品中最少10 fg的RV RNA。

Cooray S等^[15]将巢式反转录PCR进行改进，设计了可以扩增RV E1基因中592个核苷酸的引物，从先天性风疹及普通风疹病例中检测出了RV RNA，检测的灵敏度与过去报道的扩增较小片段RV RNA的巢式反转录PCR法相同，但由于这种方法扩增的片段较长，减少了与人类基因组的非特异性互补，提高了检测的特异度，也为病毒的基因分型提供了更好的方法。

5.2 多重PCR技术（multiplex PCR）

多重PCR的特点：（1）高效性。在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体^[6]；（2）系统性。多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌、性病相关病原体、无芽胞厌氧菌等同时检测；（3）经济简便性。多种病原体在同一反应管内同时检出，将显著节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。多重PCR适用于快速对临床标本进行检测，特别是混合病毒感染的样本。

6 环介导等温扩增技术

Nagamine^[17]等通过2条环状引物加快环介导等温扩增(LAMP)的反应,环状引物也是通过与茎环结构杂交,启动链置换DNA的合成。Nobuo Mori等^[18]设计了特异对应于RV E1基因第8 476位及8 680位基因片段的3对特殊引物,并在反转录酶和Bst-DNA 聚合酶的作用下对RV RNA序列进行等温核酸扩增反应。检测发现RT-LAMP的灵敏度为含30 PFU/0.1ml的细胞培养液。在此体系中对含有其他病毒（麻疹、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒及流感病毒）的细胞培养液进行RT-LAMP检测，均为阴性，说明RT-LAMP的特异度较高。对RV感染的9名患者的临床样本分别进行RT-PCR和RT-LAMP检测，其阳性率分别为66.7%和77.8%。

由于在LAMP反应中使用了3 对特异性引物,只有在3 对引物均与特异的靶序列结合时扩增反应才能进行很大程度上提高了检测的灵敏度。因为其中的一对环状引物专门用于增加扩增模板而减少反应时间,加之反转录和扩增反应在等温统一环境中一步完成,省去了反转录步骤和改变温度所需的时间。整个检测过程在65 ℃等温条件下只需1～2 h 就可完成，省去了PCR反应所需的变性、退火、延伸过程，无需特殊仪器控制反应温度，使基因扩增过程更为经济实用，易于控制。环介导等温扩增(LAMP)反应中可以形成可视的焦磷酸镁沉淀,因此，肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物。

7 其他检测方法

RV复制子的结构蛋白编码区可被如绿色荧光蛋白（GFP）或氯霉素乙酰转移酶的报道基因替代，非结构蛋白编码区有特异性框内缺失的这种复制子是不能进行复制和表达报道基因的。Wen-Pin Tzeng等^[19]的研究发现，如果临床标本中含有RV，这种基因缺失的复制子就能被修复而重新表达报道基因。这项研究可以作为一种检测RV RNA的新方法，可以检测最少1 PFU的RV，具有高灵敏度。其特异度亦较高，2种基因型的RV均可检测出，对其他人类病毒进行检测为阴性。这种方法比PCR方法简单、方便，检测过程不容易出现污染，与其他病毒也无交叉反应，是一种较理想的检测方法。

8 展望

ELISA是目前诊断RV感染的常规方法，其灵敏度与特异度较高，但其检测过程中影响因素较多，易出现假阳性结果，国内外灵敏度与特异度均较高的试剂盒还较少，还需进一步改进。蛋白质芯片与基因芯片技术高效、灵敏，随着该技术不断发展，如实验室误差逐步减小、数据处理更加完善以及成本逐渐降低，将有更广阔的应用空间。PCR技术是现在最常用的检测病毒基因的方法，灵敏度和特异度均较高，但因为影响PCR反应的因素较多，容易污染，应与其他检测方法结合使用。现在常用的检测方法只能定性检测病毒基因，无法给出定量结果，目前新出现了一种实时荧光定量PCR（fluorescent real time PCR）法，在普通PCR扩增系统中，加入一个与靶基因序列特异互补的双荧光标记探针。反应过程中产生荧光的强度与PCR产物量成正比关系。舒跃龙^[20]等用此法检测RV及麻疹病毒基因，检测范围在107～103拷贝/次，最小可检测到100个病毒拷贝。实时荧光定量PCR具有省时、省事、特异、敏感的特点，由于检测过程处于封闭或半封闭状态，污染的机会也相应减少，但需要相应的实时荧光定量检测设备。随着定量PCR技术的不断发展，将会越来越多的用于RV感染的早期检测，给临床诊断提供有力依据。各种新技术与传统检测方法相结合，使这些方法得到了不断的改进。RV的检测已不局限于使用单一方法，多种方法相互补充使检测结果更为准确。