细胞色素P450（CYPs）超家族是由微粒体血红蛋白组成，能够催化广泛的人体内外源化合物氧化、超氧化和还原代谢。细胞色素P450 2E1（CYP2E1）是其主要成员之一，占整个人肝脏CYP450总量的7%，主要负责小分子量物质如丙酮、乙醇、乙酸等及异烟肼、水杨酸类药物的代谢，以及亚硝酸胺、芳香族类致癌物的代谢活化过程^[1]。细胞色素P450 2E1在人体不同组织中都有表达，如肝脏、肺和胃肠等器官，因此，与肝癌^[2]、肺癌^{[3, 4]}、胃癌^[5]、结肠、泌尿系统等肿瘤^[6]的易患性均有一定关系。为了利用基因重组异源表达技术对细胞色素P450 2E1进行药物体外肝代谢研究，我们采用PCR方法，从国外获赠的含有CYP2E1基因质粒中获得CYP2E1 cDNA，构建并重组了CYP2E1杆状病毒粘粒。现将结果报告如下。

CYP2E1质粒（美国国立卫生研究院国家癌症研究所Frank Gonzalez博士赠）；测序载体pCMV-Myc，转座载体pFastBac1，DH10Bac大肠埃希菌（中国医学科学院基础所）；DNA聚合酶Pfu酶（北京赛百盛公司）；Taq酶、限制性内切酶、脱氧核糖核苷酸（dNTP），T4 DNA连接酶（TaKaRa大连宝生物公司）。

根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）核酸ID NM000773.3公布的CYP2E1 cDNA序列，扩增目的片段的编码区长度为1482bp，上、下游引物分别为31和25mer；上游引物设有EcoRⅠ酶切位点，下游引物设有KpnⅠ酶切位点。引物序列：上游引物序列为5'-CCGGAATTCCGGGCACCATGTCTGCCCTCGG-3'；下游引物序列为5'-GGGTACCTGTCCTCCACACACTCA-3'。

cDNA 国外获赠的CYP2E1质粒100ng，2μl的 2.5mmol/L dNTP，分别加入1μl的20 mmol/L CYP2E1上、下游引物，0.5μl Pfu酶（5U/μl），5μl 10×PCR 缓冲液，加过滤三蒸水至终体积50μl。循环参数：94℃ 5min后94℃ 1min，58℃ 45s，72℃ 3min; 共35个循环后，72℃ 10min。取5μl反应液在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

pCMV-Myc载体和PCR产物经过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切回收后，利用T4 DNA连接酶在室温下连接反应至少6 h。将连接液转化入DH5α大肠埃希菌感受态细胞中，在含有氨苄青霉素100μg/ml抗性的LB平板上筛选阳性克隆。获得的阳性克隆经过酶切鉴定后测序。

pFastBac1载体和pCMV-Myc-CYP2E1重组质粒经过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切回收酶切载体和目的片段后，利用T4 DNA连接酶在室温下连接反应至少6 h。将连接液转化入DH5α大肠埃希菌感受态细胞中，在含有氨苄青霉素100μg/ml抗性的LB平板上筛选阳性克隆。获得的阳性克隆经过酶切鉴定。

取pFastBac1-CYP2E1重组质粒转化入DH10Bac大肠埃希菌感受态细胞中，在含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素3种抗性的LB平板表面按照分子克隆中方法均匀涂布Bluo-gal和IPTG进行蓝白斑筛选，挑取蓝色菌落培养，提取空载粘粒。挑取白色阳性菌落培养，提取重组CYP2E1杆状病毒粘粒。

重组CYP2E1杆状病毒粘粒100ng，2.5mmol/L dNTP 1.0μl，20mmol/L M13正向引物0.5μl，20mmol/L M13反向引物 0.5μl，10×PCR 缓冲液 2.0μl，Taq酶 0.3μl，加过滤三蒸水至终体积20μl。循环参数：94℃ 3min后94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 5min; 共35个循环后，72℃ 10min。取5μl反应液在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

利用特异性引物扩增所获得的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上呈现单一清晰特异性条带，该片段大小约1.5kb，与设计产物大小相符。

图 1

注：1和2：CYP2E1的PCR产物；3和4：阴性对照（PCR体系中未加模板）；5：λ－EcoT14Ⅰdigest DNA Marker。 图 1 PCR扩增CYP2E1 基因片段电泳结果

pCMV-Myc-CYP2E1重组质粒和pFastBac1-CYP2E1重组质粒粒经过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后，经凝胶电泳检测，分别获得1条1.5kb条特异性带和1条大的载体条带。测序结果显示,该克隆片段含有人细胞色素P450 2E1完整的编码区，与Frank Gonzalez博士提供的序列一致。

图 2

注：2和4：λ－EcoT14Ⅰdigest DNA Marker；1：pCMV-Myc-CYP2E1重组质粒；3pFastBac1-CYP2E1重组质粒。 图 2 重组质粒双酶切后电泳结果

重组CYP2E1杆状病毒粘粒经过M13特异引物扩增后，在3.8kb处出现特异条带，空载粘粒在300bp处出现特异条带。

图 3

注：1：空载粘粒；2～5：重组杆状病毒粘粒CYP2E1；6：λ－EcoT14Ⅰdigest DNA Marker。 图 3 PCR鉴定重组CYP2E1杆状病毒粘粒的电泳结果

基因重组P450酶系可应用于药物的体外代谢途径、药物代谢产物的生成、药物的体外清除和药物-药物间相互作用等方面的研究，对临床用药具有一定的指导意义。近年来，美国Invitrogen公司开发改进了一种新型杆状病毒表达系统，即Bac-to-Bac杆状病毒表达系统。与现有的异源表达体系大肠埃希菌、酵母、哺乳动物细胞等表达系统相比，Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的酶蛋白产量高，酶蛋白活性接近于人体内药物代谢水平^[7]。本实验选择Bac-to-Bac杆状病毒表达系统来获得高产量且能保持天然活性的CYP2E1酶蛋白。PCR鉴定结果显示，空载粘粒的PCR产物可见300bp的条带，重组CYP2E1杆状病毒粘粒可见3.8kb的条带，可确定该病毒粘粒携带有完整的CYP2E1编码区，因而成功构建了重组CYP2E1杆状病毒粘粒，为下一步转染昆虫细胞，大量表达具有活性的CYP2E1酶蛋白以及利用重组CYP2E1药物代谢酶进行药物体外肝代谢研究，进行小分子前致癌物代谢及调控等研究打下基础。