中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (6): 675-677   PDF    
引用本文
吴小南, 陈忠龙, 陈洁, 汪家梨. 发酵莲子乳对小鼠肠粘膜屏障保护作用[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(6): 675-677.
WU Xiao-nan, CHEN Zhong-long, CHEN Jie, et al. Protection effect of lotus-seed milk fermented production on intestinal mucosal barrier of mice[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(6): 675-677.
发酵莲子乳对小鼠肠粘膜屏障保护作用
吴小南, 陈忠龙, 陈洁, 汪家梨     
福建医科大学公共卫生学院营养与保健医学系, 福州350004
收稿日期: 2007-09-16
基金项目: 福建省科技厅平台建设基金项目(2006F1002)
作者简介: 吴小南(1963-), 男, 福建南安人, 教授, 博士, 主要从事营养与保健资源开发研究。
摘要： 目的 验证发酵莲子乳(Lotus-milk Fermented Production, LMFP)保护小鼠肠粘膜屏障功效, 并探讨可能的作用机制。 方法 将60只清洁级ICR小鼠随机分为5组:阴性对照组和模型组给予蒸馏水, 发酵莲子乳组、莲子匀浆组、发酵乳组, 分别给予相应干预物。未次灌胃后腹腔注射细菌脂多糖(LPS)6 mg/(kg·bw), 阴性对照组给予等体积/体重蒸馏水, 18 h后处死小鼠, 采集样本检测指标。 结果 与阴性对照组比较, 各组小鼠均出现不同程度的萎靡症状, 甚至死亡, 其中模型组最严重, 发酵莲子乳组症状最轻; 与模型组比较, 发酵莲子乳可明显升高小鼠外周血白细胞总数和肠道分泌型免疫球蛋白A (SIgA)含量(P < 0.001, P=0.001), 有效维持肠道内乳酸杆菌菌量(P < 0.001), 降低LPS所升高的血浆肿瘤坏死因子-α(NF-α)水平(P=0.01), 抑制大肠埃希菌过度繁殖(P=0.001), 且发酵莲子乳功效优于发酵乳, 而莲子匀浆无保护作用。 结论 利用LPS腹腔注射小鼠成功建立肠粘膜损伤屏障模型, 发酵莲子乳可通过维持肠道菌群稳定, 增强肠道免疫机能等方式修复肠粘膜屏障损伤, 减轻全身炎症反应程度。
关键词： 发酵莲子乳     益生菌     益生元     肠粘膜屏障     脂多糖    
Protection effect of lotus-seed milk fermented production on intestinal mucosal barrier of mice
WU Xiao-nan, CHEN Zhong-long, CHEN Jie, et al     
School of Public Health, Fujian Medical University Fuzhou 350004, China
Abstract: Objective To explore the effect and mechanism of lotus-seed milk fermented production (LMFP) on the in testinal mucosal barrier of mice. Methods 60 male ICR mice were randomly assigned into five groups.The mice were pretreated intragastrically with distilled water, lotus-seed milk fermented production, lotus-seed milk and fermented milk once daily for two weeks.Twenty-four hours after the last dosing, animals were administered with LPS[6 mg/(kg·bw)]in traper itoneally, control animals were given distilled water only.Eighteen hours after the intoxication, the indices were measured. Results The mice injected with LPS showed the symptoms of sluggish in varying extent, especially in model group.The LMFP group was the most slight compared with other groups.The lotus-seed milk fermented production can signifi cantly improve the concentration of intestinal SIgA and the quantity of white blood cell (P < 0.001, P=0.001), retain the amount of lactobacillus acidophilus (P < 0.001), decrease the concentration of TNF-in serum induced by LPS and the quantity of Escherichia coli in the mouse's caecum.The protective effect of lotus-seed milk fermented production on the in testinal mucosal barrier harmed by LPS was significantly better than fermented milk, and there was no protection in lotusseed milk group. Conclusion The model of intestinal mucosal barrier harmed by LPS was established successfully.The lotus -seed milk fermented production can protect the intestinal mucosal barrier againstharm caused by LPS, and relieve the response of systemic inflammatory.
Key words: lotus-seed milk fermented production     probiotics     prebiotics     intestinal mucosal barrier     lipopolysaccharide (LPS)    

益生菌(Probiotics)能与肠道内有害微生物竞争定植位点和代谢底物从而抑制后者过度繁殖，同时可增强机体免疫系统功能，在人类健康和疾病预防中起着重要作用。而益生元(Prebiotics)能够选择性刺激宿主肠道内益生菌生长繁殖或激活其代谢功能，从而提高肠内益生菌的数量和菌群优势[1]。目前益生菌和益生元已广泛应用于发酵奶制品的开发中，其公认的保健功效是促进消化和改善胃肠道微生物系统平衡，预防腹泻和增强机体免疫机能，正成为人们预防疾病维持健康的重要生物制剂。本研究基于发酵莲子乳中乳酸杆菌等益生菌与莲子多糖等益生元对维持胃肠道功能稳定，增强机体免疫机能等方面具有协同保健效应，验证发酵莲子乳对小鼠肠粘膜屏障的保护作用，并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 发酵莲子乳、莲子匀浆、发酵乳制备

乳酸菌种(法国罗地亚公司)为保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌混合冻干菌，型号为MYE96-98；莲子为速冻新鲜建莲。(1)发酵莲子乳：速冻新鲜莲子均质化处理恒温42.5℃乳酸菌种发酵成品；(2)莲子匀浆：速冻新鲜莲子均质化处理杀菌成品；(3)发酵乳：脱脂乳粉均质化处理恒温42.5℃乳酸菌种发酵成品。

1.1.2 实验动物

清洁级ICR小鼠60只(福建医科大学动物中心)，体重(20±2)g，雌雄各半。

1.1.3 主要试剂与仪器

脂多糖(E,coli O111：B4，美国Sigma公司)；小鼠血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、ELISA试剂盒(FMK0004，晶美生物公司)；SIgA RIA Kit(IMK420，北京原子高科核技术公司)；酶标仪(BioRad公司)；全自动血球计数仪(CA-500，日本Sanyo公司)；γ-射线计数器(上海核辐光电仪器公司)。

1.2 方法 1.2.1 实验动物分组及处理

ICR小鼠60只，按体重随机分为5组：阴性对照组、模型组、发酵莲子乳组、莲子匀浆组、发酵乳组，每组12只。阴性对照组、模型组以蒸馏水2.0ml/100(gbw) )灌胃：发酵莲子乳组、莲子匀浆组、发酵乳组分别给予发酵莲子乳、莲子匀浆、发酵乳2.0ml/100(g.bw) )灌胃；以上各组每天1次，连续14d。末次灌胃后模型组、发酵莲子乳组、莲于匀浆组、发酵乳组均1次性腹腔注射细菌脂多糖(LPS)6mg/(kgbw) )，禁食18h后处死小鼠，采集样本进行指标检测。

1.2.2 检测指标及方法

1.2.2.1 一般情况 观察各组小鼠在LPS腹腔注射后15 min直至处死的活动、皮毛、大小便及死亡等情况。

1.2.2.2 外周血白细胞计数 LPS腹腔注射18h后，利用全自动血球计数仪检测各组小鼠外周血白细胞计数。

1.2.2.3 血浆TNF-α水平 采用小鼠血浆TNF-α ELISA试剂盒测定各组小鼠血浆TNF-α水平，按照试剂盒说明书进行。

1.2.2.4 肠道分泌型IgA含量 取自幽门下约5cm至近回盲部肠段，纵行剪开，轻刮肠腔内成型粪便，再用载玻片刮取肠粘膜表面粘液，用3ml 0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液(PBS)［pH=(7.5±0.1)］反复冲洗肠腔表面后，收集于5ml无菌试管内，充分震荡混匀，4℃3000r/min，离心10min，取上清，-80℃冻存待检。检测时，样本作1：100稀释，采用放射免疫法(SIg ARI AKit)测定肠道分泌型IgA含量，操作过程按试剂盒说明书进行。

1.2.2.5 盲肠内乳酸杆菌和大肠埃希菌检测 靠近回盲部剪取约1cm盲肠段，纵行剖开，刮下内容物，收集于已称重的5ml无菌试管内，称量样本重量。按质量体积比为1：10比例加入0.01mol/L无菌PBS［pH=(7.5±0.1)］进行溶解，充分振荡，使样本均质化。再用0.01mol/L无菌PBS进行10倍连续系列稀释，选择合适的稀释梯度取0.1ml分别接种于乳酸杆菌选择性培养基(LBs琼脂)和大肠埃希菌选择性培养基(EMB)，每个稀释度接种3个培养皿。接种后，乳酸杆菌选择性培养基(LBs琼脂)置于37℃厌氧培养48h；大肠埃希菌选择性培养基(EMB)置于37%需氧培养24h。培养后以菌落形态、Grams染色镜检等鉴定菌落并计数每个培养皿上的阳性菌落个数,计算每克盲肠内容物中的菌落形成单位(CFU)CFU/g=菌落数×10×10n+1(n为相应的稀释梯度)，结果用其对数值lg(cFu/g)表示。

1.3 统计分析

应用SPSS 10.0软件进行分析。各组小鼠死亡数采用x2检验；小鼠外周血白细胞计数、血浆TNF-α水平、肠道SIgA含量以及乳酸杆菌和大肠埃希菌菌落对数值(1g CFU/g)采用单因素方差分析(One-WayANOVA)。

2 结果 2.1 LPS注射后小鼠的一般状况

阴性对照组小鼠活泼好动，皮毛白细有光泽，呼吸均匀，大便成型、棕黑色；模型组小鼠在LPS腹腔注射15min后至处死前，活动明显减少，蜷缩无力，口唇青紫，眼眶出血，毛发竖起，颤抖，排粘液便，进食量锐减，采血时见血液粘稠、量少，呈暗红色；发酵莲子乳组小鼠活动减少，蜷缩无力，口唇青紫，毛发竖起，粪便成型、松软，进食量少，采血量较多，颜色稍暗；莲子匀浆组和发酵乳组小鼠状况介于模型组和发酵莲子乳组之间。

2.2 各组小鼠死亡情况

模型组、发酵莲子乳组、莲子匀浆组和发酵乳组小鼠腹腔注射LPS后18h内均有死亡出现；各组死亡数分别为：模型组3只、发酵莲子乳组1只、莲子匀浆组2只、发酵乳组1只。经x2检验，各组之间差异均无统计学意义(x2=4.205，P=0.567)。

2.3 小鼠外周血白细胞计数(表 1)

模型组小鼠外周血白细胞计数明显低于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.001)；发酵莲子乳组和发酵乳组小鼠外周血白细胞总数明显高于模型组，差异有统计学意义(P<0.00，P=0.016)；莲子匀浆组白细胞计数与模型组差异无统计学意义(P=0.155)；发酵莲子乳组与阴性对照组差异无统计学意义(P=0.173)。结果提示，发酵莲子乳和发酵乳能够拮抗内毒素所致外周血白细胞总数降低的作用，其中发酵莲子乳效果更明显。

表 1 不同组别小鼠外周血白细胞计数(x±s,109/ L)

2.4 血浆TNF-α水平检测(表 2)

模型组、发酵莲子乳组，莲子匀浆组和发酵乳组小鼠血浆TNF-α水平均显著高于阴性对照组，差异有统计学意义(均P<0.001)；发酵莲子乳组小鼠血浆TNF-α水平明显低于模型组，差异有统计学意义(P=0.01)；莲子匀浆组和发酵乳组小鼠血浆TNF-α水平与模型组比较差异无统计学意义(P=0.146，P=0.084)。结果提示，LPS腹腔注射后可造成小鼠全身性炎症反应，引起体内TNF-α水平明显升高，发酵莲子乳能够减轻炎症反应，降低LPS所致小鼠血浆高TNF-α水平。

表 2 不同组别小鼠血浆TNF-α水平(x±s,pg/ ml)

2.5 肠道分泌型IgA(SIgA)含量测定(表 3)

模型组、莲子匀浆组以及发酵乳组小鼠肠道SIgA含量与阴性对照组比较显著降低，差异有统计学意义(P<0.001，P=0.05，P=0.043)；发酵莲子乳组SIgA含量虽低于阴性对照组，但差异无统计学意义(P=0.219)；发酵莲子乳组和发酵乳组明显高于模型组，差异有统计学意义(P=0.001，P=0.013)；莲子匀浆组SIgA含量与模型组差异无统计学意义(P=0.095)。结果提示，发酵莲子乳能够促进小鼠肠粘膜SIgA的分泌，增强肠道相关淋巴组织的免疫功能。

表 3 不同组别小鼠肠道SlgA含量(x±s,μg/ ml)

2.6 盲肠内乳酸杆菌和大肠埃希菌菌数变化(表 4)

模型组、发酵莲子乳组、莲子匀浆组和发酵乳组小鼠盲肠内乳酸杆菌菌数比阴性对照组显著减少(均P≦0.001)；发酵莲子乳组和发酵乳组鼠盲肠内乳酸杆菌菌数明显高于模型组，差异有统计学意义(均P<0.001)；发酵莲子乳组乳酸杆菌菌数明显高于发酵乳组，差异有统计学意义(P<0.001)。模型组、发酵莲子乳组、莲子匀浆和发酵乳组小鼠盲肠内大肠埃希菌菌数显著增多，与阴性对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.001)：发酵莲子乳组小鼠盲肠内大肠埃希菌菌数明显少于模型组(P=0.001)；莲子匀浆组和发酵乳组小鼠盲肠内大肠埃希菌菌数与模型组相比差异均无统计学意义(P=0.274，P=0.075)。结果提示，发酵莲子乳和发酵乳能够维持肠内乳酸杆菌菌数，抑制大肠菌埃希繁殖，有利于肠道菌群稳定，其中发酵莲子乳作用更显著。

表 4 不同组别小鼠盲肠内乳酸杆菌和大肠埃希菌菌数(x±s,lgCFU/ g)

3 讨论

肠道是体内最大的贮菌库和内毒素库，完整的肠上皮细胞间连接、SlgA以及菌群间竞争性抑制能有效阻止肠腔内细菌和内毒素移位[2-4]。因此，肠粘膜屏障功能的稳定与胃肠道疾病的发生发展密切相关。

发酵莲子乳中的乳酸杆菌等能以磷壁酸与肠道粘膜上皮细胞紧密结合，有效阻止内毒素移位，抑制血浆TNF-α水平升高[5]。而莲子多糖等益生元可促进益生菌在肠道内存活和繁殖，起到定植佐剂的作用。莲子中的抗氧化物质如抗坏血酸、谷胱甘肽等也有助于减轻炎症反应[6]。SIgA与革兰阴性杆菌有特殊的亲和力，可以阻止后者与肠粘膜的粘附和定植，并中和内毒素[7]。发酵莲子乳可参与肠粘膜SIgA水平的调节，改善肠道局部免疫功能，其机制可能是乳酸杆菌菌体成分及其代谢产物和莲子多糖等对肠粘膜有非特异免疫刺激作用，提高肠道相关淋巴组织免疫功能，促进浆细胞分泌SIgAf[8]。乳酸杆菌还可以通过竞争性占位、分泌乳酸、胞外糖苷酶等活性物质抑制肠道条件致病菌，提高益生菌群比例，维持肠道微生态稳定。Coconnier等[9]研究发现，乳酸杆菌代谢产物对肠道致病细菌具有明显的抗菌活性。此外，发酵莲子乳的调节效果优于发酵乳，也进一步证实了莲子多糖等益生元具有促进益生菌在肠道内生长、定植的能力。

综上所述，发酵莲子乳中的乳酸杆菌等益生菌可以通过调节肠道菌群、增强肠道免疫机能等方式维护肠粘膜屏障正常功能。在此基础上引入对益生菌有促进作用的莲子多糖等益生元成分，可以充分发挥益生菌和益生元对肠道保健功能的协同效应，为胃肠道建立了一个良好的微生态环境，增强机体健康。

(感谢福建农林大学食品科技学院郑宝东教授对本研究工作的热情指导和大力支持。)

参考文献
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