食品微生物污染主要由食源性致病微生物引起，而人类腹泻性传染病大多源于食源性病毒感染。与该类病毒有关的食品主要是贝类食品。由于贝类食品中病毒含量较低，其检测方法主要以RT-PCR和荧光PCR为主^[1]。RT-PCR比荧光RT-PCR方法灵敏度低、耗时长；荧光RT-PCR方法具有高灵敏度的特点，但检测成本高。无论是人体或贝类均存在同时感染几种病毒的情况^[2-4],本研究利用基因芯片高通量、高特异性和高灵敏度的特点，用于检测贝类食品中上述5种病毒，缩短检测时间，达到同时检测2～3种病毒的目的。

1 材料与方法 1.1 材料

粪便标本(2岁以下婴幼儿粪便标本，于2005年10月在首都儿童医院收集)；贝类样品(北京各农贸市场)；甲肝阳性标本为灭活的甲肝疫苗(北京市疾病预防控制中心)，脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型阳性标本为灭活疫苗(北京疾病预防控制中心赠送)；甘氨酸(上海生工生物工程公司)；氯仿(上海生工生物工程公司);Trizol(Invitrogen)；聚乙二醇8000(BBI)；十二烷基磺酸钠(上海生工生物工程公司)；三羟甲基氨基甲烷(上海生工生物工程公司)；病毒总RNA提取试剂盒(High Pure ViralRNA Kit Roche)；检测5种病毒的病毒芯片(博奥生物有限公司)，点样液、洗脱液和杂交液等试剂(博奥生物有限公司)；5种病毒探针和引物由英俊生物有限公司合成，引物的5′端引入TAMARA修饰，探针的5′端引入氨基，见图 1。

1.2 方法

粪便标本RNA的提取方法参照参考文献^[1]。反转录使用Super ScripⅡ反转录酶(Invitrogen)，操作步骤按说明书；PCR使用Tag酶(Invitrogen)，PCR反应程序见表 1，PCR产物用1%琼脂糖电泳(上海Yito生物仪器有限公司)。本研究所用引物和探针见表 2；芯片杂交体系见表 3，杂交方法如下：42℃恒温水浴杂交2h，洗片：洗液Ⅰ：2×柠檬酸钠缓冲液(SSC)，0.2%十二烷基磺酸钠(SDS)，42℃4min；洗液Ⅱ：0.2×SSC，42℃4min。贝类样品的处理和贝类RNA的提取方法参照文献^[1]。荧光PCR按下列方法进行，cDNA模板1μl，MgCl² 1.6μl，正链引物(RotAF)0.8μl(10μmol/L)，负链引物(RotAR)0.8μgl(10μmol/L)，DNA Master SYBR Green I MIX 2μl(上海生工生物工程公司)，用无核苷酸酶的水将体积补足到20μl。

2 结果 2.1 基因芯片检测结果和分析

5种病毒基因芯片杂交扫描检测结果见图 2～6。通过以上杂交扫描结果可以看出，目标探针特异性好，不同病毒之间不存在交叉反应；同时，背景信号的平均值、标志点的信号平均值、特异性信号平均值、非特异性信号的平均值本身都完全符合判定标准。

2.2 基因芯片检测灵敏度评价

以轮状病毒为例，将基因芯片方法、普通PCR方法和荧光PCR方法在cDNA水平进行检测灵敏度比较，将轮状病毒的cDNA进行梯度稀释，将未经稀释的cDNA原液、10倍稀释cDNA、10²倍稀释cDNA、10³倍稀释cDNA、10⁴倍稀释cDNA、10⁵倍稀释cDNA，分别进行荧光PCR、普通PCR和芯片杂交分析。结果表明，cDNA原液、10倍稀释cDNA和10²倍稀释cDNA的荧光PCR结果有明显的反应信号，信号随稀释度增加呈递减趋势；普通PCR方法，只有cDNA原液和10稀释cDNA经PCR反应，检测到PCR产物外，其他几个稀释度均没有检测到PCR产物；芯片杂交结果显示，cDNA原液、10倍稀释cDNA和10²倍稀释cDNA，经PCR反应，与芯片杂交可判读的杂交信号呈阳性，该结果与荧光PCR结果相一致，比普通PCR灵敏。

2.3 基因芯片稳定性评价

以甲肝病毒检测芯片为例，在37℃加速保存24h，相当于4℃保存45d。本研究在37℃保存5d，相当于4℃保存7.5个月，见图 7～10。

以上结果表明：通过37℃加速保存试验，在37℃条件下保存5 d相当于4℃条件下保存7.5个月，芯片的杂交信号保持不变。

2.4 基因芯片高通量试验

将2种以上病毒的RT-PCR产物混合后进行芯片杂交，见图 11～14。

以上高通量试验结果可以看出，将2种以上不同病毒的RT-PCR产物混合，与芯片进行杂交，不同病毒之间没有发生交叉反应，说明该芯片具有良好的特异性。

2.5 基因芯片用于贝类食品中致病病毒的检测

从水产品市场购买了46份水产品，种类包括毛蚶、海虹、扇贝、文蛤、螺丝和鲍鱼，46份均为鲜活的水产品，只从1份毛蚶中检出了诺如Ⅱ型病毒，其结果与RT-PCR结果相对应。轮状病毒、星状病毒、甲肝病毒和脊髓灰质炎病毒在所有样品中均未检出。

3 讨论

本研究以贝类食品中常见污染病毒如诺如病毒、星状病毒、轮状病毒、甲肝病毒和脊髓灰质炎病毒为实验对象，通过将发表在Gene Bank中的这5种病毒的全序列和部分序列进行比较，找到高度保守的核苷酸序列，以此为依据用相关软件设计引物和探针。分别设计了检测诺如病毒Ⅰ型和Ⅱ型的引物和探针、检测甲肝病毒的引物和探针、检测轮状病毒的引物和探针、检测星状病毒的1对引物和3条探针和检测脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型的探针和引物，通过对探针和引物的特异性验证，结果表明引物和探针具有良好的特异性，在5种病毒之间无交叉反应，与其他遗传关系相近的病毒之间无交叉反应，达到了病毒检测高通量的目的。轮状病毒芯片的实验结果提示，基因芯片的检测灵敏度与荧光PCR方法的检测灵敏度基本相同，但是，芯片检测灵敏度尚需通过其他方法进一步验证。今后通过建立多重RT-PCR技术，使得芯片检测更加快速和经济建立贝类食品中上述5种病毒检测的标准方法。

(感谢首都儿童医院感染科化验室的全体工作人员为我们收集粪便标本提供了条件；感谢北京疾病预防控制中心为我们提供了脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型灭活疫苗。)