登革病毒(Dengue Virus,DEN)是白纹伊蚊(Aedes albopictus)及埃及伊蚊(Aedes aegypti)传播黄病毒属(flaviviridae)的家族成员，为一种单股正链RNA病毒。目前，贵州省DEN尚无感染疫情报告，但贵州省白纹伊蚊分布密度较高，并对DEN普遍易感^[1]。2002年本实验室从贵州省麻尾地区的自然界白纹伊蚊体内分离到1株DEN-2；证明兴义市等地自然界白纹伊蚊体内存在DEN核酸，贵州省具备DEN感染自然条件。本研究于2005年6～10月采集贵州省独山县、兴义市不明原因发热病人的血清标本进行检测分析，旨在为贵州省预防和控制DEN感染提供科学依据。

于2005年6～10月由独山县、兴义市疾病预防控制中心协助采集不明原因发热病人血清356份。

NS1基因区通用引物的合成根据《全国登革热监测方案》提供的DEN NS1区DEN1～4型通用引物，由北京赛百盛公合成1对扩增序列长度均为539bp引物。引物序列为：上游引物(P+)：5′-GTGCACATTGACAGAACA-3′下游引物(P-)：5′-CTTTCTATCCAATAACCCAT-3′。

改良碘化钠法提取血清中总RNA。

取样本RNA作为模板作逆转录合成cDNA链，然后进行PCR扩增。循环反应条件：RT，42℃ 60min,95℃ 5min;PCR,94℃预变性5min;94℃ 40s,55℃ 45s,72℃ 60s，进行30次循环。UVP-凝胶成像仪观察成像并记录实验结果。同时作阳性对照(DEN-2参考株的cDNA作模板)和C6/36细胞对照，以监控扩增质量。

发热病人血清标本接种于6/36细胞，用登革热病毒(DEN NS1)基因区特异性引物经RT-PCR检测病毒核酸，可见在500～600bp范围内有一条带，与预期的539bp相符，而正常C6/36细胞上清未见到任何条带。对1～3份标本的DEN病毒核酸进行了序列测定。结果与相应血清中直接PCR检测到DEN NS1核酸序列一致。从356份血清标本中检测到DEN检酸35份，阳性率为9.83%。由大连宝生物工程有限公司对其中7份标本的PCR产物进行纯化并测序。结果显示，7份DEN NS1基因部分碱基序列与NGC株分别比较有差别，不同标本DEN NS1基因部分碱基序列也有差异(表 1)。

表 1

表 1 7份标本DEN-NS1部分序列与NGC株相应序列比较

表 1 7份标本DEN-NS1部分序列与NGC株相应序列比较

结果显示，将测序所知的核苷酸序列与基因库(GenBank)中选取16株较完整的DEN-2 NS1区相应的核酸序列资料(海南DEN-2-04株、海南DEN-2-44、马来西亚Nc-001474株、泰国16681株、台湾Taiwan-1008株、古巴Cuba205/97株、印度尼西亚TB16i株、多米尼加DR23/01株、牙买加Jamaica/N.1409株、澳大利亚TSV01株、福建FJ-10株、福建FJ-11株、广西DEN-43株、日本ThNH81/93株、法国H/IMTSSA-MART/98-703株、NGC株)，进行多组核酸序列同源性比较，结果与DEN-2-43同源性较高，为97.4%(525/539)；7份株本之间的同源性为97.6%(526/539)(图 1)。

图 1

图 1 DEN-2 NS1基因区核酸序列同源性比较

DEN主要由埃及伊蚊及白纹伊蚊传播的RNA病毒，其流行病学是一个非常复杂的过程。目前对其流行规律、流行间隔时间及致病机制尚不完全清楚^[2]。我国目前登革热(DF)流行地区均处于北纬23°5′以南的热带及临近热带的亚热带地区^[3]，其流行与白纹伊蚊的分布及带毒率有着密切关系^[4]。贵州省位于北纬24°38′～29°14′之间，虽无埃及伊蚊分布，但有白纹伊蚊的广泛分布且对DEN普遍易感。与我省毗邻的广西、云南等省近年来均有DEN感染流行或者从自然界蚊体内分离到DEN的报道。本实验室2002年从贵州省麻尾地区的自然蚊虫体内成功地分离出1株DEN-2，证明兴义市等地自然界白纹伊蚊体内存在DEN核酸，说明贵州省存在DEN感染流行的可能性。本研究通过对贵州省独山县、兴义市两地夏秋季不明原因发热病人血清中进行DNE核酸检测，其阳性率为9.83%。证明贵州省独山县、兴义市两地人群中存在DEN的散发感染。对其部分RT-PCR产物进序列测定，结果显示其碱基序列与NGC株之间存在一定的差异，相互之间也存在差异。