糖尿病肾病（DN）是糖尿病最严重和最常见的慢性并发症，其发病机制与氧化应激和非酶糖基化作用的增强有关。研究显示，在糖耐量异常（IGT）阶段，肾脏即已出现早期损伤，但病理学改变尚属可逆期，及时治疗可完全恢复，一旦进入糖尿病期，治疗不及时，肾组织损伤加重并不可逆转，最终可发展成终末期肾衰^[1]。因此，在糖耐量异常阶段研究糖尿病肾病的有效干预措施具有重要的临床意义和价值。大豆异黄酮（SI）是生物类黄酮的一种，具有较强的抗氧化特性。近年来，有关大豆异黄酮对糖尿病防治的研究已有报道^{[2, 3]}。本实验建立D-半乳糖诱导的IGT大鼠糖耐量异常模型，观察大豆异黄酮对血糖及肾损伤的影响，并从氧化和非酶糖基化的角度探讨其作用机制，为其在早期预防糖尿病及慢性并发症方面的开发应用提供实验依据。

4~6周龄无特定病原体（specefic pathogen free，SPF）级健康雄性SD大鼠50只（广东医学实验动物中心），许可证号:SCXK（粤）2003-0002，粤监证字:2006A015。标准饲料饲养，温度22~25℃，湿度75%。

大豆异黄酮，纯度40%（广州同格保健食品厂）；二甲双胍（metformin，met）片（深圳中联制药厂，批号:20060803）；D-半乳糖（D-gal;上海源聚生物科技有限公司，批号:060127）；丙二醛试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶测定试剂盒和超氧化物歧化酶测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；尿微量蛋白试剂盒（上海太阳生物技术有限公司）；%型胶原酶，纯度>95%;碘化丙啶（美国Sigma公司）。日本GLUCOCARD^TM Test Strip & 血糖仪及试纸;Tecan光栅型酶标仪（Magellan软件）；M750-B型多功能紫外可见分光光度计;荧光分光光度计;Leica F W4000正立及电动荧光显微镜。

健康SD大鼠适应性喂养10d后,按体重随机抽取10只作正常对照组（NC），腹腔注射生理盐水，2ml/kg，连续8周;其余大鼠腹腔注射D-半乳糖溶液,150mg/（kg·d），连续2周，然后按体重及50%葡萄糖10g/kg灌胃后2h血糖值，将大鼠分成模型组（蒸馏水）、二甲双胍组（150mg/kg）、大豆异黄酮低剂量组（100mg/kg）和高剂量组（200mg/kg）；每组10只，分别灌胃，持续6周;开始灌胃的同时，将D-gal剂量调至200mg/（kg·d），2周后用量增至250mg/（kg·d），继续注射至8周末，以维持糖耐量异常大鼠 模型的稳定。

实验末期，采集各组大数血清，测定大鼠空腹血糖及餐后2h血糖;采集随机尿液，测定尿微量白蛋白含量;腹腔注射36mg/（kg·bw）戊巴比妥钠溶液麻醉动物，下腔静脉采血，制备血清，测定血尿素氮水平。摘取大鼠两侧肾脏，去被膜，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，滤纸吸干后称重，待用。

（1）制备细胞悬液:取一半右肾，用眼科剪剪碎后，加适量PBS悬浮细胞，压滤通过200目尼龙筛，制得单细胞悬液，离心，弃上清，用PBS将细胞密度调整至104~105个/ml，以台盼蓝排斥法^[4]计算细胞存活率，以细胞存活率在95%以上为标准。（2）彗星实验:根据文献^[5]方法稍作改进。（3）图像分析:荧光显微镜通过成像系统与图像分析系统相连，随机计数300个细胞，统计视野中彗星细胞数，以百分数表示拖尾细胞率。

取另一半右肾，称重后剪碎,用生理盐水制成10%组织匀浆，离心，取上清。按试剂盒说明书方法测定肾脏GSH-Px、SOD活性和MDA含量。

取左肾皮质，参照文献^[6]方法，用荧光分光光度法检测AGEs相对含量，激发波长370 nm，发射波长440nm，测定荧光值，以0.1mol/LCaCl2缓冲液荧光值为1个任意荧光单位（AUF），样品荧光强度依此折算，结果以AUF/（mg·pro）表示。

采用SPSS13.0软件进行统计分析;组间差异采用方差分析，若各组方差齐，采用多组平均数两两比较的Tukey检验，若各组方差不齐，采用两两比较的Tamhane’sT2检验。

（1）空腹血糖及灌胃葡萄糖2h后血糖:表 1可见，模型组与正常对照组比较，空腹血糖差异无统计学意义（P>0.05）；灌胃50%葡萄糖（10g/kg）2h后，模型组大鼠血糖水平较正常组明显升高（P<0.05）；大豆异黄酮高低剂量干预组餐后2h血糖较模型组明显降低（P<0.05），以高剂量组作用明显，但高低剂量组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。二甲双胍组餐后2h血糖也明显低于模型组，但与大豆异黄酮高低剂量比较差异无统计学意义。结果表明，大豆异黄酮对D-半乳糖所致糖耐量异常有改善作用，其效果与二甲双胍相近。（2）血尿素氮及尿微量白蛋白含量:表 1还显示，模型组大鼠与正常对照组大鼠比较，血尿素氮（BUN）含量差异无统计学意义（P>0.05）；模型组大鼠尿微量白蛋白（MAU）含量显著高于正常对照组（P<0.05），大豆异黄酮高低剂量组和二甲双胍组尿微量白蛋白含量均明显低于模型组（P<0.05），表明大豆异黄酮对肾脏早期损伤有保护作用。

表 1

表 1 大豆异黄酮对糖耐量异常大鼠生化指标的影响（x±s）

表 1 大豆异黄酮对糖耐量异常大鼠生化指标的影响（x±s）

表 2可见，模型组与正常对照组比较，肾脏SOD活性明显降低（P<0.05），MDA及AGEs含量均明显增高（P<0.05），但GSH-Px活性差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，大豆异黄酮高低剂量组和二甲双胍组肾脏SOD活性明显增高，MDA及AGEs含量显著降低（P<0.05），大豆异黄酮高低剂量组AGEs含量明显低于二甲双胍组（P<0.05），以高剂量降低AGEs作用更明显。结果表明，大豆异黄酮具有抗氧化和糖基化的作用，其功效优于二甲双胍。

表 2

表 2 大豆异黄酮对糖耐量异常大鼠肾脏GSH-Px、SOD活性、MDA含量及AGEs的影响（x±s）

表 2 大豆异黄酮对糖耐量异常大鼠肾脏GSH-Px、SOD活性、MDA含量及AGEs的影响（x±s）

图 1可见，正常对照组DNA未受损，肾细胞核大小比较均一，无拖尾，呈圆形，模型组大鼠DNA受损的肾细胞有1个像彗星一样的拖尾，并且其彗星尾随损伤的加重而加长，大豆异黄酮干预6周后，拖尾现象明显改善，其作用明显优于二甲双胍。表 3也可见，模型组肾脏细胞DNA拖尾率明显高于正常对照组，大豆异黄酮高低剂量干预6周后，细胞DNA拖尾率均明显低于模型组，且其效果优于二甲双胍组。从细胞拖尾率数值上看，低剂量大豆异黄酮降低细胞拖尾率的作用比高剂量大豆异黄酮更强。

图 1

图 1 各实验组大鼠肾脏DNA单细胞凝胶电泳图

表 3

表 3 大豆异黄酮对糖耐量异常大鼠肾脏细胞DNA氧化损伤程度的影响

表 3 大豆异黄酮对糖耐量异常大鼠肾脏细胞DNA氧化损伤程度的影响

有研究表明^[7]，D-半乳糖不仅可使机体产生大量自由基，机体抗氧化能力降低，而且还可干扰体内正常的糖、脂代谢。本实验通过剂量递增法，给大鼠连续8周腹腔注射D-半乳糖后，模型组大鼠空腹血糖处于正常范围，而餐后2h血糖明显增高，表明大鼠已处于糖耐量异常状态。尿微量白蛋白含量的明显增高，预示肾组织已出现早期损伤，表明糖尿病肾病在糖耐量异常阶段就已经启动，与文献^{[8, 9]}报道一致。而肾组织抗氧化酶活性的降低，MDA和AGEs含量的增多,以及肾细胞DNA拖尾率的增高，则提示糖耐量异常阶段机体已存在明显的氧化应激和非酶糖基化作用的增强。用不同剂量的大豆异黄酮对糖耐量异常大鼠干预6周后，大鼠餐后2h血糖水平、尿微量白蛋白含量、MDA含量、AGEs水平及肾脏细胞DNA拖尾率均明显降低，SOD活性明显升高，表明大豆异黄酮具有明显改善糖耐量异常和肾组织损伤的作用。其机制可能与大豆异黄酮通过抗氧化作用减轻自由基对肾组织细胞脂质、蛋白质、DNA等大分子的氧化损伤，以及抑制非酶糖基化反应对肾组织的损伤有关。

本文结果显示，模型组大鼠血尿素氮量虽高于其他各组,但差异无统计学意义，表明由D-半乳糖注射8周引起的肾脏损伤尚处于早期阶段，其滤过和排泄等功能尚未出现明显的减退，因此，血尿素氮水平变化不明显，提示血尿素氮水平不能作为肾脏早期损伤的敏感指标。同时，大豆异黄酮对肾组织GSH-Px活性改变不明显，提示大豆异黄酮在肾组织的抗氧化作用主要是通过提高SOD活性，清除超氧阴离子自由基为主。结果还发现，不同剂量的大豆异黄酮对抗氧化酶活性及AGEs的影响表现不一致，并未呈现明确的剂量-效应关系，因此，大豆异黄酮保护肾脏损伤的最佳剂量还需进一步研究。

与传统降糖药二甲双胍比较，大豆异黄酮降低肾组织AGEs含量的作用明显强于二甲双胍，其他指标与其相近，表明大豆异黄酮非常有价值开发成早期预防糖尿病及肾病的临床辅助药。