茶多酚(Tea Polyphenols，TP)是茶叶中含有的一类多羟基酚类化合物的总称，具有抗氧化、防癌、降血脂、预防心血管疾病、抗衰老等生物活性^[1]。血管内皮细胞受损是动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)等疾病发生的始动因素。高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)是多种疾病的危险因子，尤其是发生动脉粥样硬化及其并发症的独立危险因素之一^{[2, 3]}，可损伤内皮细胞从而启动AS的发生。为了解血浆Hcy水平升高引起AS的发病机制，本实验采用TP作为受试物，从Hcy对粘附分子影响的角度，观察TP对Hcy细胞毒性的抑制作用，为TP预防AS作用机制研究提供科学依据。

TP(纯度>95%)(浙江中科植物技术有限公司)；人脐静脉内皮细胞株(山东大学细胞生物学教研室)；酶链亲和素-生物素-过氧化酶复合物(SABC)试剂盒和3-氨基-9-乙基卡唑(AEC)显色液(武汉博士德生物工程有限公司);兔抗细胞间粘附分子(inter cellular adhesion molecule-1,ICAM-1)多克隆抗体、兔抗E-selectin多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)。

将冻存诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）复苏后，用含10%灭活小牛血清、100 IU/ml青霉素、100 IU/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，37℃、5% CO₂饱和湿度条件下传代培养。实验用均处于对数生长期细胞。将对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化，调细胞浓度为1×10⁶/L，取适量细胞悬液接种于培养板或培养瓶。实验分为4组：对照组、TP组、Hcy组及Hcy+TP组。TP及Hcy的终浓度分别为25和5 mmol/L，对照组加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS)。

取适量细胞悬液接种于96孔培养板。24 h后，按实验分组要求剂量分别加入Hcy(5 mmol/L)和TP(25 mg/L)。24 h后，加MTT溶液10 μl，继续培养4 h，弃去培养液，加150 μl二甲基亚砜（DMSO），570/492 nm测定吸光度值（A)，计算细胞增殖率，每组平行样品7个。增殖率=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。

调整对数生长期细胞浓度为1×10⁶/ml，取适量接种于预先放有处理过玻片的6孔培养板中。24 h后，按实验分组要求剂量分别加入Hey和TP。继续培养24 h，取出玻片，按试剂盒进行免疫组化实验，显色后，显微镜下观察、拍照。采用柯达形态分析系统，以积分吸光度(integrated optical density，IA)将结果量化处理。

采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析(one-ANOVA)及最小显著差法(LSD)两两比较。

不同组细胞中分别加入TP、Hcy共同培养24h后，MTT测定结果显示，在25mg/L浓度下，茶多酚对正常细胞的生长几乎无抑制作用(4.9%，P>0.05)，Hcy可明显抑制HUVEC的生长(36.0%，P<0.05)，加入TP后则明显降低Hcy所致的细胞生长抑制(7.9%，P>0.05)。

表 1

表 1 MTT法测定HUVEC细胞增殖率（x±s）

表 1 MTT法测定HUVEC细胞增殖率（x±s）

ICAM-1蛋白表达的影响蛋白ICAM-1多存在于内皮细胞和上皮细胞表面，正常情况下可持续表达，但量很低。对照组细胞染色较浅；TP组细胞与对照组细胞形态和染色深浅区别不明显，ICAM-1表达降低了3.8%(P>0.05)；Hcy作用于HUVEC，染色加重，ICAM-1蛋白表达升高了29.9%(P<0.05)；加入TP以后，ICAM-1表达下调了17.9%(P<0.05)。

表 2

表 2 IP及Hcy对HUVEC粘附分子ICAM-1和E-selectin表达的影响（%，x±s）

表 2 IP及Hcy对HUVEC粘附分子ICAM-1和E-selectin表达的影响（%，x±s）

E-selectin蛋白表达的影响 E-selectin蛋白在HUVEC细胞的表达也主要是在细胞表面，正常情况下很少表达或不表达，对照组细胞染色后很难与背景区分；TP组细胞与对照组细胞形态和染色深浅区别不明显，E-selectin表达降低了7.2%(P>0.05)；Hcy组细胞形态发生改变，染色加深，E-selectin的表达上调了37.7%(P<0.05)，加入TP以后，E-selectin表达下调了24.6%(P<0.05)。Hcy引起ICAM-1和E-selectin表达上调，而TP逆转了Hcy的作用使ICAM-1和E-selectin表达下调。

AS是一种慢性炎症性疾病，其形成涉及许多过程，1969年McCully首先提出HHcy和AS相关。Hcy可引起包括管腔轻度狭窄、平滑肌细胞增生活跃、内膜增厚、弹力纤维排列紊乱等AS的早期改变^[4]。本试验表明，加入Hcy后，HUVEC细胞可发生明显的形态学改变，Hcy对细胞的这种毒作用可能是通过其过氧化作用和诱导内皮细胞粘附分子表达异常升高造成的。

细胞粘附分子(cell adhesion molecules，CAMs)在维护正常组织稳定、介导炎性细胞迁移、血栓形成等过程中起重要作用^[5]。ICAM-1作为组织损伤处白细胞外渗的先决条件，介导内皮细胞与白细胞之间的粘附，这种粘附是动脉粥样硬化的早期过程之一^[6]。E-selectin可与白细胞上表达的一些细胞因子结合导致白细胞在内皮细胞上流动减慢，形成滚动，并为以后白细胞贴壁以及游出血管到达炎症部位进一步创造条件^[7]。本试验免疫组化结果显示，TP能明显抑制Hcy诱导的2种粘附分子ICAM-1和E-selectin蛋白表达水平的上调。推测TP可能通过抑制粘附分子E-selectin表达，抑制白细胞在内皮的滚动；进而抑制ICAM-1，防止白细胞附壁，从而起到预防粥样斑块产生，延缓动脉粥样硬化进程、改善血液粘稠度的作用。