中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (5): 581-583   PDF    
引用本文
杨颖, 蔡玟, 黄志彪, 黄俊明, 李文立, 黄健康. 环磷酰胺致小鼠免疫功能低下模型建立与评价[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(5): 581-583.
YANG Ying, CAI Wen, HUANG Zhi-biao, et al. Establishment and evaluation of immunosuppressive model in mice influenced by cyclophosphamide[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(5): 581-583.
环磷酰胺致小鼠免疫功能低下模型建立与评价
杨颖, 蔡玟, 黄志彪, 黄俊明, 李文立, 黄健康     
广东省疾病预防控制中心毒理所, 广州510300
收稿日期: 2007-08-23
基金项目: 广东省重点医学科技攻关专项课题〔粤卫(2003)246号〕;广东省医学科学技术研究基金项目(A2003074)
作者简介: 杨颖(1974- ),女,安徽人,副主任医师,硕士,研究方向:化妆品和保健食品毒理。
摘要： 目的 建立环磷酰胺致免疫低下模型,应用流式细胞术检测小鼠自然杀伤细胞(NK)细胞分化抗原CD69+/自然杀伤细胞G2D受体(NKG2D+)和T淋巴细胞分化抗原CD69+/CD3+评价其免疫低下动物模型中的应用. 方法 以环磷酰胺强化注射、少量多次注射、一次大剂量注射分别建立免疫低下模型,30 d后处死,取外周血和脾,分别检测小鼠外周血自然杀伤细胞(NK)亚群CD69+/NKG2D+和外周血T淋巴细胞CD69+/CD3+亚群,同时进行脾NK细胞活性测定,ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验,观察环磷酰胺对外周血T淋巴细胞、NK细胞免疫功能的影响. 结果 环磷酰胺强化注射、少量多次注射均可使小鼠外周血和牌的活化的NK细胞和T淋巴细胞比例及T淋巴细胞转化增殖能力、脾NK细胞活性降低. 结论 环磷酰胺强化注射可以长时降低小鼠细胞免疫功能的作用,适用于建立长期免疫低下模型;流式细胞术检测T淋巴细胞和NK细胞分化抗原在免疫调节功能评价中有较好应用价值.
关键词： 保健食品     免疫低下     动物模型     CD69+/CD3+     CD69+/自然杀伤细胞G2D受体(NKG2D+)    
Establishment and evaluation of immunosuppressive model in mice influenced by cyclophosphamide
YANG Ying, CAI Wen, HUANG Zhi-biao, et al     
Center for Disease Control and Prevention of Guangdong Province Guangzhou 510300, China
Abstract: Objective To establish an immununosuppressive model in mice,to evaluate application of flowcytometry in health food evaluation. Methods Once injection with middle dose and intensification in proper intervals,daily inject ion with minor dose and once injection with large dose were used in establishing the model and an appr oved functional food was tested to validate the model.The main indexes used in the study were CD69+/CD3+;CD69+/NKG2D+;prolification capacity of lymphocyte(PCL)and NK cell activity. Results In once injection with middle dose and intensification in proper intervals,daily injection with minor dose groups,CD69+/CD3+,CD69+/NKG2D+ PCL and NK cell activity were significantly lower than those in the control group. Conclusion With once injection and intensificat ion in proper intervals method,a proper immunosuppr essive animal model for the functional food evaluating system can be established.CD69+/CD3+,CD.69+/ NI G2D+ has good susceptivity and application value in the immunity function evaluation of healtlh food.
Key words: immunosuppression     animal model     CD69+/CD3+     CD69+/NKG2D+    

增强免疫力是指通过外来干预手段,增强人体免疫力的举措。由于具有增强免疫力功能的产品多用于免疫水平较低的人群,用免疫低下动物模型进行评价更接近实际情况[1, 2]。流式细胞术分析T 淋巴细胞和自然杀伤细胞( NK) 等细胞免疫功能具有快速、多参数、可定量、操作简便等优点,国外已有较多报道[3, 4]。本文拟以环磷酰胺为造模剂建立一套小鼠免疫功能低下模型,结合双色荧光标记、流式细胞术检测外周血T 淋巴细胞CD69+ / CD3+、外周血NK 淋巴细胞CD69+ / 自然杀伤细胞G2D 受体(NKG2D+) 表达情况,观察环磷酰胺对小鼠细胞免疫功能的影响,为免疫调节评价体系中动物模型的选择提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物和实验室

SPF 级Balb/ C 种雌性小白鼠24只,6~ 8 周龄,体重16~ 20g( 第一军医大学医用动物场) 合格证书号2003A046。动物实验室: SPF 级,合格书粤检证号2001C059,室温( 22± 2) e ; 湿度50%~ 75%。

1.1.2 仪器和试剂

流式细胞仪( FACS Calibur,美国Bec2ton Dickinson 公司) ; 全自动酶标仪( 芬兰Labsystems 公司) ; 环磷酰胺( 上海华联制药有限公司,批号: 001106) ;NP240 ( 德国Fluka 公司,批号: 2000/ 01) ; NKG2D( 藻红蛋白标记,Cat: E008303) ; CD3 用磷脂酰乙醇胺荧光素标记( PE) 、CD69 用( 异硫氰酸荧光素标记FITC,Cat- E004450) ; 单克隆抗体、同型对照以及溶血素( 美国Phar Mingen 公司) 刀豆球蛋白A ( ConA) ( 美国Worthington Biochemical 公司,批号:50K904J) ; 四甲基偶氮噻唑蓝( MTT) ( 美国Biotec 公司,批号: BS0887) ; 2% 和20% 绵羊红细胞( SRBC) 悬液自行制备( 生理盐水洗涤3 次,2 000 r/mim 离心5min) 。

1.2 方法 1.2.1 模型分组

按体重随机分组方法,将40 只健康小鼠随机均分为4 组: 正常对照组( N S 组) 、模型A、B、C 组,每组10 只。( 1) 正常对照组( NS 组) 给予生理盐水。( 2) 模型A组: 采用环磷酰胺80mg/ kg 剂量连续注射3 d,造成相应免疫低下,再以一定周期( 每周相同剂量) 适时强化1 次。( 3) 模型B 组: 采用环磷酰胺1 次大剂量( 100 mg/ kg) 注射造成免疫低下,不再强化。( 4) 模型C 组: 采用环磷酰胺小剂量( 40 mg/kg) 连续注射30 d 造成免疫低下,于第1 次给予环磷酰胺后30 d 检测相应指标。

1.2.2 小鼠外周血T 淋巴细胞亚群CD69+ / CD3+比值检测[5]

摘除小鼠眼球,立即取50 Ll 肝素抗凝血与4 LlCD3( 磷脂酰乙醇胺荧光素标记,PE) 单抗和9Ll CD69( 异硫氰酸荧光素标记,FITC) 单抗混合,室温下避光孵育30 min,用015 ml溶血素准确裂解红细胞10 min,1 300 r/ min,离心5 min 获取有核细胞,用磷酸盐缓冲液( PBS) 洗涤2 次后用流式细胞仪分析,标记的细胞经前向散射(Forward scarer ,FSC) 和侧向散射(Side scatter,SSC) ,在二维Dot- Plot 图中划出淋巴细胞区,然后对淋巴细胞进行FITC 和PE 荧光强度检测,其中FITC 为荧光1(FLl) ,滤光片带通为( 530 ± 115) mm,PE 为荧光2( FL2) ,滤光片带通为( 585 ± 21) hm,数据显示于双色散点图(FLI 与FL2) 中。测定时各荧光通道均以相同类型( lso2type) I gG 染色作为同型对照,计数10 000 个淋巴细胞,经FACS Calibur 流式细胞仪及CellQuest 软件获取和分析。

1.2.3 小鼠脾T 淋巴细胞亚群CD69+ / CD3+比值检测

处死小鼠后,无菌取出脾脏,放入115 mlPBS 液中研磨,200 目不锈钢网过滤,将脾细胞调成5@105/ ml 的单细胞悬液后,取50 gl 细胞悬液与4 Ll CD3( PE) 单抗和9 Ll CD69( FIT C) 单抗混合,避光孵育,溶血,离心,洗涤,用流式细胞仪分析。

1.2.4 小鼠外周血NK 细胞亚群CD69+ / NKG2D+比值检测[7]

摘除小鼠眼球,立即取50 Ll 肝素抗凝血与215 LlNKG2D 单抗和1Ll CD69 单抗混合,室温下避光孵育30min,用01 5ml 溶血素准确裂解红细胞10 min,离心,洗涤,用流式细胞仪分析。

1.2.5 小鼠脾NK 细胞亚群CD69+ / NKG2D+比值检测[7]

处死小鼠后,无菌取出脾脏,放入11 5 ml PBs 液中研磨,200目不锈钢网过滤,将脾细胞调成5@105/ ml 的单细胞悬液后,取50 Ll 细胞悬液与215 Ll NKG2D 单抗和1 Ll CD69 单抗混合,避光孵育,溶血,离心,洗涤,用流式细胞仪分析。

1.2.6 小鼠脾NK 细胞活性测定( LDH 法)

参照文献[1]方法按以下分式计算NK 细胞活性。NK 细胞活性%= ( 反应孔A- 自然释放孔A) / ( 最大释放孔A- 自然释放孔A) @100,NK 细胞活性转换值: X= Sin- 1( P) 1/ 2。

1.2.7 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验( 四甲基偶氮噻唑蓝法,MTT 法)

参照文献182方法,在酶标仪570 nm 波长处测定吸光度( A) 值,以加ConA 孔的吸光度值减去不加CortA 孔的吸光度值代表淋巴细胞的增殖能力。

1.3 统计分析

采用SPSS101 0 统计软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果 2.1 环磷酰胺对T 淋巴细胞影响( 表 1) 2.1.1 环磷酰胺对T 淋巴细胞CD69+ / CD3+检测结果

从表 1 可见,环磷酰胺模型A、C 组外周血和脾的T 淋巴细胞比例CD69+ / CD3+较阴性对照组降低,提示环磷酰胺强化注射、少量多次注射造模可降低小鼠T 淋巴细胞CD69、CD3 的表达。

表 1 环磷酰胺对小鼠脾淋巴细胞转化反应的影响( x±s)

2.1.2 环磷酰胺对T 淋巴细胞转化增殖能力检测结果

从表 1 可见,环磷酰胺模型A、C 组T 淋巴细胞转化增殖能力较阴性对照组降低,提示环磷酰胺强化注射、少量多次注射造模有降低小鼠T 淋巴细胞转化增殖能力的作用。

2.2 环磷酰胺对NK 细胞影响( 表 2) 2.2.1 环磷酰胺对NK 细胞影响

从表 2 可见,环磷酰胺对NK 细胞CD69+ / NKG2D+检测结果,环磷酰胺模型A、C 组外周血和脾活化的NK 细胞比例( CD69+ / NKG2D+) 均较阴性对照组明显降低,提示环磷酰胺强化注射、少量多次注射造模可降低小鼠NK 细胞CD69、NKG2D 的表达。

表 2 环磷酰胺对小鼠NK 细胞活性的影响( x± s)

2.2.2 环磷酰胺对NK 细胞活性的影响

从表 2 可见,环磷酰胺模型A、C 组NK 细胞活性较阴性对照组均降低,提示环磷酰胺强化注射、少量多次注射造模有降低小鼠NK 细胞活性的作用。

3 讨 论

目前常用的化学造模剂有环磷酰胺、氢化可的松、地塞米松、环孢菌素A、放线菌素、长春新碱等。环磷酰胺因其是常用的肿瘤化疗药之一而应用最广。有文献报道,环磷酰胺模型多采用一次大剂量给药的方式造模[8]。本研究结果表明,一次较大剂量造模、适时强化的方法,不仅能有效降低免疫功能,且操作简便,适用于建立长期免疫低下横型。

外周血T 细胞亚群是公认的反应细胞免疫状态较好的指标[9]。CD3 是外周血中代表成熟T 淋巴细胞最好标志物之一[10]。NK 细胞被认为是机体天然免疫的第一道防线,起到连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁作用[11]。其抑制受体主要包括杀伤细胞免疫球蛋白受体( KIR) 和CD69/NKG2D 复合体1122。细胞分化抗原CD69 作为一种早期激活抗原,在体外实验中是一个好的活化细胞的标忐物1132。流式细胞术现广泛应用于探讨机体免疫反应以及机体免疫调节的影响,被认为是血液中淋巴细胞表型分析的标准方法[14-16] 。本研究采用流式细胞术进行免疫低下模型的T 淋巴细胞和NK 细胞分化抗原检测。结果显示,T 淋巴细胞比例(CD69+ / CD3+) 、NK 细胞比例( CD69+ / NKG2D+) 与传统指标T 淋巴细胞转化增殖能力、NK 细胞活性具较好一致性,说明这项指标具有敏感性强、有效性高的特点,可用于快速、简便而有效地评价细胞免疫功能,在免疫功能学评价中有较好的应用价值。

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