中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (5): 577-579   PDF    
引用本文
邓暑芳, 李素云, 何爱桃, 贺性鹏. 甲基叔丁基醚对胎鼠神经元和神经递质影响[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(5): 577-579.
DENG Shu-fang, LI Su-yun, He Ai-tao, et al. Effect of MTBE on Glu and nNOS of brain tissues of fetal mice[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(5): 577-579.
甲基叔丁基醚对胎鼠神经元和神经递质影响
邓暑芳1,2, 李素云1, 何爱桃1, 贺性鹏1     
1. 南华大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室, 湖南衡阳421001;;
2. 湘南学院护理系
收稿日期: 2007-08-14
基金项目: 湖南省自然科学基金项目(06jj5052)
作者简介: 邓暑芳(1968- ),女,湖南邵阳人,主管护师,硕士,研究方向:神经毒理学。
通讯作者: 贺性鹏
摘要： 目的 探讨大鼠妊娠期甲基叔丁基醚(MTBE)暴露对胎鼠脑组织神经元型一氧化氮合酶(nNOS)及神经递质谷氨酸(Glu)的影响. 方法 40只健康成年昆明种小鼠于妊娠第0 d开始至妊娠结束期间,用食用油稀释的不同浓度MTBE 0,25,100,400,800 mg/(kg·bw)进行灌胃染毒,每天1次,直到胎鼠出生.用免疫组化的方法(SABC)观察胎鼠脑组织中nNOS和神经递质Glu免疫阳性神经元的表达. 结果 当MTBE的剂量为400 mg/(kg·bw)时,胎鼠大脑皮质、海马和小脑nNOS和Glu阳性神经元细胞数较对照组减少(P<0.05),染色强度变浅,并存在明显的剂量-效应关系. 结论 妊娠期母鼠接触MTBE可致胎鼠脑组织nNOS及神经递质Glu的表达下降.
关键词： 甲基叔丁基醚     神经递质     谷氨酸     神经元型一氧化氮合酶    
Effect of MTBE on Glu and nNOS of brain tissues of fetal mice
DENG Shu-fang, LI Su-yun, He Ai-tao, et al     
School of Public Health, University of South China Hengyang 421001, China
Abstract: Objective To explore the effect of methyl tertiar y-bitul ether(M T BT)on nNOS and neurotransmitter Glu of brain tissues of fetal mice during gestation. Methods 40 healthy and pregnant K M mice were distributed in five groups randomly.The MT BE exposed doses were 800,400,100,25 and 0 mg/(kg·bw)by gavage from the 0 d to the end of gestation,once perday.The immunohisto-chemical method(SABC method)was used to check the expression of nN OS and neurotr ansmitter Gluin the brain tissues of the fetal mice. Results The expression of then N OS and neurotransmitter Gluin the cerebral cortex,hippocampus and cerebellum of the fetal mice was dereased when the exposed dose was 400 mg/kg·bwand the data showed a dose-effect relationship. Conclusion MTBE can decreased the content and activities of nNOS and neurotransmitter Gluin the braintissue of the fetal mice.
Key words: methl tertiany-butyl ether(M T BE)     neurotr ansmitter     Glu     nNOS    

甲基叔丁基醚(Methyl tertiary-butyl ether,MTBE)作为一种新型的汽油添加剂，可替代四乙基铅作为汽油抗爆剂，已被国内外广泛使用。在炼油厂、加油站、汽车修理厂职业接触MTBB者越来越多，对职业人群危害范围也不断增加。同时储油库汽油的泄漏可导致地下水环境的污染。国内外学者对MTBE的急性、亚慢性和慢性毒性研究较多，但有关MTBE对胎鼠中枢神经系统的实验研究报道较少。本实验用MTBE对妊娠期母鼠进行染毒，观察MTBE对胎鼠脑组织神经递质的影响，为探讨妊娠期间接触MTBE对其子代神经系统生长发育的影响提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

MTBE(湖南长岭炼油厂)，纯度为98.7％。用食用植物油将MTBE配成不同所需染毒浓度，兔抗一氧化氮合酶(nNOS)多克隆抗体、兔抗神经递质谷氨酸(Glu)多克隆抗体、即用型免疫组化法(SABC)试剂盒。二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德公司)。

1.2 动物模型制备

健康性成熟的昆明种小鼠(南华大学实验动物部)，体重在25～28g,每晚8：00至次晨8：00将雌雄小鼠按2：1比例合笼，次日早晨8：00检查雌鼠阴栓，见阴栓日定为妊娠第0d。

1.3 孕鼠分组和染毒方法

40只孕鼠随机分为4个不同剂量的MTBE染毒组(25，100，400，800mg/(kg.bw) ))和食用油对照组，每组8只孕鼠。染毒时间为受孕第0d开始至妊娠结束，按每0.1ml／(10g.bw) )进行灌胃染毒，每天染毒1次。对照组给予同剂量食用油。

1.4 检测方法 1.4.1 脑组织取材

胎鼠出生后6～12h内称重，观察生长发育情况。每组8窝胎鼠从每窝中各取1只断头处死，剥离头皮，用4％多聚甲醛磷酸缓冲液固定24h后剥离颅骨，再固定24h。固定好的脑组织按常规脱水、包埋、切片厚5m放4℃冰箱中待用。

1.4.2 SABC免疫组化反应

将切片常规脱蜡至水化，3％过氧化氢室温孵育5min；0.1％胰蛋白酶消化5min；5％正常小牛血清室温封闭20min；1：50兔抗nNOS多克隆抗体或兔抗Glu多克隆抗体于4℃冰箱孵育12h；生物素化的羊抗兔IgG室温孵育30min SABC室温下20min；过氧化物酶底物作用液(DAB)显色，显微镜下控制显色强度。以上每一步反应后均需用0.02mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，pH=7.2～7.40，漂洗干净，所有反应均在湿盒中进行，阴性对照实验采用PBS代替一抗，其余步骤相同。常规脱水透明，中性树胶封片。

1.4.3 镜下观察

取相同断面的脑组织切片观察大脑皮层、海马及小脑皮层nNOS、Glu阳性神经元细胞的分布、形态、染色强度，计数各区nNOS和Ghu阳性神经元数量。大脑皮层细胞数为400倍下随机计数每张切片3个视野的阳性神经元细胞平均数；小脑皮层细胞数为每张切片小脑皮层的阳性神经元细胞数；海马细胞数为每张切片单侧海马的阳性神经元细胞数。

1.5 统计分析

采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，多重比较采用最小显著差法(SLD)。

2 结果 2.1 MTBE对胎鼠脑组织nNOS的影响(表 1，图 1)

妊娠期母鼠在接触25，100mg/(kgbw) )MTBE时，胎鼠大脑皮质、海马和小脑nNOS阳性神经元细胞数较对照组略有增加(P＞0.05)。当剂量增加到400，800mg/(kgbw) )时，胎鼠大脑皮质、海马和小脑nNOS阳性神经元细胞数明显减少(P＜0.05)，染色强度变浅，并呈现明显的剂量-效应关系。

表 1 MTBE对胎鼠脑组织nNOs表达的影响( x±s, n= 8)

注：A：大脑皮质对照组；B：大脑皮质800mg/kg·bw) 组；C：小脑皮质对照组；D：小脑皮质800mg/kg·bw) 组；E：海马对照组；F：海马800mg/kg·bw) 组。 图 1 MTBE对胎鼠脑组织nNOS的影响(免疫组织化学SABC法，×400)

2.2 MTBE对胎鼠脑组织神经递质Glu的影响(表 2、图 2)

孕鼠接触MTBE剂量为25，100mg/(kgbw) )时，胎鼠大脑皮质、海马和小脑Glu阳性神经元细胞数较对照组略有增加(P＞0.05)当染毒剂量达到400,800mg/(kgbw) )时，Glu阳性神经元细胞数明显减少，染色强度变浅，呈明显的剂量-反应关系。

表 2 MTBE对胎鼠脑组织神经递盾Glu表达的影响( x±s, n= 8)

注：A：大脑皮质对照组；B：大脑皮质800mg/(kg.bw) )组；C：小脑皮质对照组；D：小脑皮质800mg/(kg·bw) )组；E：海马对照组；F：海马800mg/(kg·bw) )组。 图 2 MTBE对胎鼠脑组织神经递质Glu的影响(免疫组织化学SABC法，×400)

3 讨论

MTBE对神经系统可产生急、慢性毒性作用[1]。Glu是中枢神经系统内含量最高的兴奋性氨基酸神经递质，在谷氨酸脱羧酶(GAD)作用下，可转化为抑制性神经递质-氨基丁酸(GABA)，并一起维持体内的兴奋和抑制平衡。Glu通过GluR(NMDA、AMPA等)介导一系列重要的神经生理活动[2]。本实验结果显示，MTBE可使Glu表达降低，其原因可能是MTBE激活c-fos基因转录，进一步激活目的基因GAD转录，使GAD含量增加[3, 4]，使Glu转化为GABA。李素云[3]等研究发现，MTBE中毒时，实验动物呈麻醉状态，认为与脑组织内GABA含量增加，活性增强有关。WayneC,D等[5]研究发现，大鼠吸入MTBE后出现明显中枢神经系统抑制效应。本研究结果提示，动物的麻醉状态或抑制效应可能与Glu含量减少有关，是GABA与Glu相互作用的结果。

本实验结果显示，MTBE可使nNOS表达降低，推测其原因可能是，MTBE可导致胎鼠脑组织内Glu含量减少，使NMDA受体活化受到限制，影响细胞外Ca2++内流并与CaM的结合，导致nNOS激活减弱[6]。

NO不仅参与突触传递过程，还可以充当第二信使介导兴奋性氨基酸，参与长时程增强(LTP)机制的形成；另外NO可作为信息分子，弥散到突触后膜，激活鸟苷酸环化酶，使神经递质Glu释放增加，从而促进LTP效应的维持[7]。LTP是学习和记忆的重要神经基础，Glu和nNOS均在LTP的过程中起重要作用。因MTBE所导致的胎鼠脑组织中nNOS和神经递质Glu的含量减少是否影响其智力发育和记忆功能，有待于进一步研究。

参考文献
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[5] Wayne C D, Michael W G, Irvin M, et al. Neurotoxicological evalu?? at ion of methyl tertiary-butyl ether in Rat s[J]. Journal of Applied t oxicology, 1997, 17(1) : 57–64.
[6] Glantz SB, Cianci CD, Iyer R, et al. Sequent ial degradat ion of alpha II and betal I spectrin by calpain in glut amate or maitot oxin-st im?? ulat ed cells[J]. Biochemist ry, 2007, 46(2) : 502–513. DOI:10.1021/bi061504y
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