阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以进行性痴呆为主要临床表现的神经退行性疾病，主要病理变化为大脑皮质和海马出现神经炎性斑（NP）、神经纤维缠结（NFT）及神经元死亡，其发病机制至今未明。有研究表明，其发病与病毒感染和遗传背景有关^[1]。我们用间接ELISA法测定18例阿尔茨海默病(AD)病人和20名正常对照者血浆中抗EB病毒VCA IgG、IgM类抗体；PCR法检测样本血浆和有核细胞中EB病毒DNA；通过直接测序法检测其外周血载脂蛋白E（ApoE）基因的基因型、分析单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），旨在探讨EB病毒感染和遗传基因对AD发病的影响。

病人来源于贵阳医学院附属医院或贵阳中医学院第二附属医院。痴呆诊断标准参照美国精神疾病诊断统计手册修订版（DSM-Ⅳ）^[2]，全部应用简易精神状态量表(MMSE)、认知能力鉴别量表、日常生活能力量表(ADL)和Hachinski缺血指数评分量表，进行痴呆评价和鉴别诊断，血管性痴呆(SAD)组Hachinski缺血指数＜4分；AD病诊断标准参照美国国立神经病学、语言障碍和阿尔茨海默病及相关疾病协会（NINCDS-ADRDA）标准^[3]，根据细微精神状态检查(MMSE)量表测试均为中、重度认知障碍，积分在6～16分之间^[3]。经断层扫描或核磁共振排除脑卒中、脑肿瘤、梗阻性脑积水、硬膜下血肿等相关疾病。AD组18例，其中男14例，女4例，年龄57～86岁，平均（65±11.6）岁。对照组为20名正常健康老年人，男12名，女8名，年龄60～78岁，平均(64±10.5)岁，经体检和神经心理测试无记忆和智能障碍。上述研究对象均未应用精神抑制药物，无明确感染史。病例为随机选择，各组受试者的年龄、性别等差异无统计学意义。

抗EBV VCA IgG、IgM类抗体试剂盒（德国Virion/Serion公司）；自动酶标检测仪（美国BIO-TEK公司）。PCR检测仪（德国Eppendorf公司）。

采集受检者清晨空腹静脉抗凝血3ml，常规方法分离血浆和有核细胞，血浆置-85℃保存备用，有核细胞用于提取DNA备用。

利用常规间接ELISA法，按试剂盒说明书操作。

经典酚/氯仿抽提法提取有核细胞DNA，TE溶解，-20℃保存备用；血浆中病毒DNA用Ready PCRTM血清－病毒DNA纯化系统^[4]（华美生物工程公司）。

按照参考文献^[5]发表的序列，扩增位于疱疹病毒科病毒DNA多聚酶基因区靶序列，上海生物工程有限责任公司合成引物。

扩增条件：94℃预变性7 min；92℃ 60 s，58℃ 60 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃延伸7 min。再用SmaⅠ和BamHⅠ对产物进行酶切。EBV片断：SmaⅠ酶切后为424 bp与100 bp,BamHⅠ酶切后为277 bp与247 bp。

扩增条件：95℃预变性5 min；94℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 50 s，30个循环；72℃延伸5 min。E4-1扩增条件：95℃预变性5 min；94℃ 30 s，62℃ 40 s，72℃ 50 s，30个循环；72℃延伸5 min。E3、E4-2扩增条件：95℃预变性5 min；94℃ 30 s，58℃ 40 s，72℃ 50 s，30个循环；72℃延伸5 min。E-2、E-3、E4-1、E4-2扩增片段长度分别为246，300，560，398bp。

将经1.5% 琼脂糖凝胶电泳后出现较亮目的条带，且无干扰条带的E2、E3、E4-1、E4-2标本应用ABI377型自动测序仪进行DNA测序。根据电泳条带和测序结果确定每个标本的等位基因型，直接计数法计算基因型频率。

采用SPSS 11.5软件进行统计学处理。组间基因型频率和等位基因频率差异比较用x²检验或Fisher确切概率法检验。抗体阳性率差异用Fisher确切概率法检验。

VCA抗体的检测 AD组、老年对照组中抗EBV VCA IgG类抗体阳性的例数分别为72.2%（13/18）和30.0%（6/20）。显示AD病人血浆抗 EBV VCA IgG类抗体阳性率较正常对照明显升高（P＜0.05）；而且EBV VCA IgG类抗体的A值也明显高于对照组（P＜0.05）。

VCA IgG抗体检测 AD（18例）中，12例（66.7％）有核细胞检出EBV DNA，此12例中有9例（50.0％）血浆亦检出；对照组（20例）中，4名（20.0％）有核细胞检出EBV DNA，其中3名（15.0％）AD组与对照组比较，有核细胞中EBV核酸检出率差异有统计学意义（x²＝8.464，P＝0.004）。

AD组4/4与3/4并为一组后与正常对照组相比有统计学意义（P＜0.05）；4等位基因的频率与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；其他基因型及2，3等位基因频率与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表 1

表 1 载脂蛋白E基因的基因型和等位基因频率的分布

表 1 载脂蛋白E基因的基因型和等位基因频率的分布

ApoE基因外显子4多态性是ApoE基因分型的依据,本实验在检测样本中仅检测到ApoE基因外显子4第112和158位密码子上发生碱基替换，即单个核苷酸由T替换为C。

AD发病与载脂蛋白E基因的基因型分布和EB病毒感染情况，对EBV感染、携带ApoEε4两者与阿尔茨海默病发病进行相关性分析P＝0.017，OR95%CI=1.925～5.134,表明两者同时存在为AD危险因子。

表 2

表 2 EBV感染情况和载脂蛋白E基因的基因型分布

表 2 EBV感染情况和载脂蛋白E基因的基因型分布

在EBV活化状态下,机体EBV VCA IgG类抗体水平增高^[5] ，成年后高滴度的EBV VCA抗体除了出现于传染性单核细胞增多症，亦可出现于霍奇金病、慢性淋巴细胞白血病、结节病、系统性红斑狼疮和可能由于免疫状况改变致使潜伏的病毒活化而发生的其他疾病中。本研究中AD组抗EBV VCA lgG类抗体阳性率明显高于对照组，且其A值较对照组明显升高，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。提示AD发病与EBV的既往感染及其活化有一定相关性。本研究还发现，AD病人外周血有核细胞和血浆中EBV DNA检出率（分别为66.7％和50％）明显高于对照组（P＜0.05），说明EBV DNA与AD患者DNA的整合率高于正常组。提示AD病人发生EBV近期感染的可能性较小，而与潜伏EBV的再激活关系密切。上述结果支持EBV核酸可整合到宿主细胞染色体内并能长期传代，推测体内的EBV潜伏或许就是AD患者所谓的“易病素质”，有利于AD发生。

迄今为止，EBV在AD发生发展中的作用还不清楚，但本研究结果提示，EBV感染与AD的发生有一定关系。病毒和ApoE两者存在于同一个体可能是阿尔茨海默病的危险因子，EBV出现在ApoEε4携带者脑内可能为导致AD原因，而ApoE也可能在病毒的潜伏和激活中均起到重要作用，提示对AD患者进行抗病毒治疗是可行之策。