2008, Vol. 24
我国近几年流脑呈上升趋势，近期尚出现聚集性疫情[1]。分析脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，N.m) 菌群分布、变迁趋势、制定疫苗接种措施对该病的防控至关重要，及时准确诊断及分群鉴定对流脑早期监控和合理快速使用有效疫苗具有重要流行病学意义。脑膜炎奈瑟菌的传统诊断方法主要是细菌分离培养、染色镜检、生化鉴定和血清学分群、血清凝集等。本文建立脑膜炎奈瑟菌核酸诊断和快速基因分群方法，并对部分分离到的流脑菌株进行基因分群鉴定评价。结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 菌株及试剂（1） 脑膜炎奈瑟菌（N.m）分离株：分离自2005年11月～2006年6月浙江省流脑临床患者分离株54株、暴发疫情及带菌者调查中健康带菌者分离株35株。病例及带菌者资料来源于浙江省疾病监测系统。（2）阳性对照菌株：A、B、C群N.m株（中国生物制品检定所提供，本单位菌种室保存）。（3）阴性对照菌株：乙型溶血性链球菌（β-hemolytic streptococcus,S.β-hemo），表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis,S.epi）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae,V.cho）等（本单位分离并保存）。（4）试剂：API NH鉴定试剂（法国梅里埃公司）；脑膜炎奈瑟菌单克隆抗体诊断血清（美国Remel公司）；Qiamp DNA抽提试剂盒（美国Qiagen公司）。
1.2 方法 1.2.1 菌株分离与鉴定按常规方法进行。分别经样本处理、分离培养及生化鉴定等，符合脑膜炎奈瑟菌菌落形态、培养特性及生化特征。
1.2.2 血清凝集分群按常规玻片凝集方法进行。
1.2.3 基因分群采用多重PCR方法进行。(1)核酸提取:使用Qiamp DNA抽提试剂盒，按说明书进行核酸提取，并置4℃备PCR检测。(2)引物序列:根据已报告的引物序列[2-4]设计并合成特异性引物（上海生工公司合成），引物序列分别为，porA上游引物 5'-CCGCACTGCCGCTTGCGG-3'，下游引物 5'-CGCATATTT AAAGGCATA-3'；siaD(Y1)上游引物5'-CTCAAAGCGAAGGCTTTGGTTA-3'，下游引物5'-CTGAAGCGT TTTCATTATAATTGCTAA-3'；mynB/sacB(A1)上游引物5'-CGCAATAGGTGTATATATTCTTCC-3'，下游引物5'-CTGAATAGTTTCGTATGCCTTCTT-3'；siaD (C1),上游引物 5'-TCAAATGAGTTTGCGAATAGAAGGT-3',下游引物5'-CAATCACGATTTGCCCAATTGAC-3';siaD (B1)上游引物5'-GGATCATTTCAGTGTTTTCCACCA-3',下游引物 5'-GCATGCTGGAGGAATAAGCATTAA-3';siaD (Y & W135)上游引物5'-GGTGAATCTTCCGAGC AGGAAA-3'，下游引物5'-AAAGCTGCGCGGAAGAATAGTG-3'。(3) 反应体系：10×PCR buffer（Mg2＋free）5l，25mmol/L的 MgCl24l，dNTP4l (每种2.5mmol/L，终浓度200mmol/L)，每条引物除porA 为0.8l外，其他均为0.4l（终浓度0.4mol/L），Taq酶0.3l（5U/l，日本TaKaRa公司)，待测模板2l，加ddH20～50l。（4）反应条件：针对不同反应管，所有循环条件经梯度PCR优化组合确定最佳条件为：94℃ 预变性5min，94℃ 60s，58℃ 60s，72 ℃90s，30个循环，最后72℃延伸5min（Eppendorf）。（5）产物鉴定：扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶（含EB 0.5g/l）电泳（MiniRun GE-100型电泳仪）100V，45min，GENIUS凝胶成像仪（FR-200A 型）获取图像。
1.2.4 特异性试验采用如上阴性对照菌株，并设模板阴性对照，按上述方法同时进行PCR扩增；对与血清凝集分群法结果不同的菌株，另取PCR扩增产物进行基因序列测定（上海生工公司），并与阳性参考株比对。
1.2.5 敏感性试验采用平板菌落计数法对阳性参考株进行菌落计数：取0.5个麦氏单位浓度（约1.5×108/ml）的菌悬液，作一系列的倍比稀释，取1000万个起连续10倍稀释至1个菌的稀释管，各取100l菌液进行平板培养，根据培养出的菌落数，计算培养物中的活菌浓度。按上述方法同步进行PCR，测定方法敏感性。
1.2.6 同源性分析及分群效率比较采用Blast软件[5]将测序结果与GenbanR数据库进行同源性分析，用Mega 3.1软件进行分离株与阳性参考株不同群别同源性分析。将多重PCR方法特异性基因鉴定及基因分群的结果，与血清凝集法进行分群效率比较。
1.3 统计分析采用SAS 8.2统计软件进行分析。
2 结果 2.1 基因分群结果（1） PCR反应条件和体系优化：MMg2＋最佳终浓度为2.0mmol/L。6对引物分别扩增6种不同的基因片段，可在同一PCR循环条件（经最佳优化）下进行。（2）最佳组合：不同引物间出现相互竞争与拮抗现象，最佳组合与分组为：①孔蛋白A特异性基因(P3rA)和Y群特异性基因siaD (Y 1)；②A群特异性基因mynB/sacB (A1)和C群特异性基因siaD (C1)；③B群特异性基因siaD (B1)和Y群及W135群特异性基因siaD (Y & W135)。
2.2 PCR特异性阴性对照菌株均未见扩增出脑膜炎奈瑟氏菌脑膜炎奈瑟菌的特异性条带，阳性对照菌株分别扩增出脑膜炎奈瑟菌不同群别的特异性基因片断以及共同的脑膜炎奈瑟菌特异性PorA基因片断（图 1）；与血清凝集分群法结果不同的菌株，另取PCR扩增产物进行基因序列测定，用Blast软件将测序结果与GenebanR数据库的脑膜炎奈瑟菌基因组序列进行比对，同时与阳性参考株的测序结果比对，同源性＞96％，分析结果支持基因分群法。
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注：1～5，7：脑膜炎奈瑟菌分离株。其中1，3，4为A群扩增阳性；2.5，7为B群扩增阳性：6，8～9：3种阴阴对照菌株；9～12及13～15：3种阳性参考株；M(100～1000bp)引物使用：A板采用A组引物；B板采用B、C组引物。其中9～12分别采用B、C、B组引物：13～15为引物空白对照。 图 1 相同反应条件下不同基因组的扩增 |
2.3 PCR敏感性
在3组引物的反应体系中，PCR敏感性为83CFU/反应（图 2）。
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注：1～4、5～8、9～12和13～15，17：A、B、C、A群菌株，分别使用B、C、A组引物。其中DNA模板梯度分别为83000，8300，830，83CFU。阳性对照模板：18～20：A、C、B群阳性参考株，分别使用B、C、B组引物。阴性对照模板：16，21～22：阴性对照菌株S.β-hemo,S.epi和V.cho,使用A组引物；M：DNA ladder(100～100bp)。 图 2 阳性参考株3组基因扩增敏感性试验 |
2.4 核酸鉴定
核酸序列分析结果表明，A、B、C群阳性参考株基因组序列进行比对，分离株A、B、C群同源性均达96％以上。
2.5 分群效率（1） 2种方法分群效率比较：在89株菌中，血清凝集法有16株不能定群，分群效率为82.02％；多重PCR法均能定群（并经基因测序证实），分群效率为100%，差异有统计学意义（x2＝15.4514，P＜0.0001）。提示多重PCR分群效率优于血清凝集法。（2）血清凝集法对不同人群分离株分群效率：临床现症患者54株中，4株不能定群，分群效率92.59％；健康携带者35株中，12株不能定群，分群效率为65.71％，差异有统计学意义（x2＝8.6613，P=0.0033），表明血清凝集法对健康携带者的脑膜炎奈瑟菌分群效率低于临床患者。（3）临床患者分离株分群效率比较：临床患者54株中，血清凝集法不能定群的4株,经多重PCR法定群为A群1株，B群1株和C群2株，并经基因测序证实。(4)健康带菌者分离株分群效率比较：健康带菌者35株菌中，血清凝集法不能定群的12株，经多重PCR法定群为A群4株，B群6株和C群2株，并经基因测序证实。表明在健康带菌者中,多重PCR分群效率优于血清凝集法。
2.6 菌群分布89株分离株中,A群占60.69％(54/89）;B群占24.69%(22/89）;C群占1.462%(13/89），未检出其他群别。其中患者分离株A群占40.45%(36/89),B群占12.36%(11/89),C群占7.87%(7/89)；健康携带者A群占20.22%(18/89),B群占12.36%(11/89),C群占6.74%(6/89)；构成比例差异均无统计学意义（x2＝2.0934，P=0.3511）。
3 讨论脑膜炎奈瑟菌至少有13个血清群，其中A,B,C,Y,和W135几乎覆盖了99％以上的病例[6]。因此，本次研究主要采用相关引物扩增PorA目的基因进行脑膜炎奈瑟菌基因鉴定；扩增A,B,C,Y,和W135目的基因以达到分群目的。
A群曾是引起世界各地大流行的主要菌群，引起局部流行的主要为B群；而在美国、加拿大、巴西、越南等国的局部流行则主要为C群。2000年以来，某些国家和地区出现W135群的暴发[7-9]。在我国，随着A群脑膜炎球菌多糖疫苗的广泛应用，A群发病率明显下降，自1990年以后，A群已由96.9％降至61.7％，而B群和C群却相对的增多10。本次研究表明，2005年秋至2006年春浙江省流脑菌群分布为A（60.69％）、B（24.69%）和C（14.62%）群。目前我国主要疫苗株为A、C群,我国人群对其他群别基本无免疫力，一旦发生流行或暴发后果不堪设想。因此，建立敏感、有效的疾病监测系统，发展流脑实验室快速诊断及高效准确的分群方法，对及时发现疫情，对疾病的流行和预测作出快速、准确的评估、指导疫苗使用及紧急预防至关重要。
本文结果表明，应用多重PCR方法，可以对脑膜炎奈瑟菌进行快速基因鉴定及分群，其分群效率（100％）优于传统的血清凝集法（82.02％）。特别是在带菌者调查中，前者分群效率为100％，血清凝集法仅为65.71%。提示在对流脑带菌者进行流行病学监测中，使用本方法能得到更准确可靠的结果。而在临床患者中的分群效率由于病例较少，2种方法的差异无统计学意义。对与血清凝集分群法结果不同的菌株，进行基因序列分析，结果表明,测序结果与PCR分群结果相符，提示所建立的方法敏感性及特异性均优于血清凝集法。本文所建立的方法曾在突发疫情应急检测中得到应用,对某些临床已使用抗生素或保存不当的标本，仍然可以得出满意结果,这对流脑早期监控和疾病流行的实验室快速反应具有广阔的应用前景。
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