中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (5): 523-525   PDF    
引用本文
聂海祺, 罗姚佳, 文涛, 孙黎光, 李剑平. 塞来希布对胃癌细胞增殖抑制作用[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(5): 523-525.
NIE Hai-qi, LUO Yao-jia, WEN Tao, et al. Approach of gastric carcinoma cells proliferation inhibited by celecoxib[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(5): 523-525.
塞来希布对胃癌细胞增殖抑制作用
聂海祺1,3, 罗姚佳2, 文涛4, 孙黎光1, 李剑平3     
1. 中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室, 沈阳110001;
2. 中医科大学第90期学生;
3. 辽宁省血液中心;
4. 辽宁省疾病预防控制中心
收稿日期: 2007-09-06
基金项目: 国家自然科学基金(39870384);辽宁省教育厅高校科研项目基金(2004DI73)
作者简介: 聂海祺(1976- ),男,河北乐亭人,主管检验师,硕士,主要从事生物化学与分子生物学研究。
通讯作者: 孙黎光
摘要： 目的 观察塞来希布对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进胃癌BGC-823细胞的增殖抑制影响,探讨塞来希布抑制肿瘤细胞增殖的机制. 方法 不同浓度组的塞来希布作用于经25 ng/ml bFGF作用后的胃癌BGC-823细胞,用蛋白印迹(western blot)分析法检测环氧化酶-2(COX-2)、核转录因子-κB(NF-κB)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达变化. 结果 25 ng/ml bFGF通过PKB信号转导通路能增强胃癌BGC-823细胞中COX-2、NF-κB、VEGF蛋白的表达,对胃癌BGC-823细胞有促增殖作用,呈时间依赖性(P<0.01).不同浓度组的塞来希布对经25 ng/ml bFGF作用的胃癌BGC-823细胞中COX-2、NF-κB、VEGF蛋白的表达均有抑制作用(P<0.01). 结论 塞来希布对bFGF促进BGC-823胃癌细胞的增殖有一定的抑制作用.
关键词： 塞来希布     BGC-823细胞     碱性成纤维细胞生长因子     增殖    
Approach of gastric carcinoma cells proliferation inhibited by celecoxib
NIE Hai-qi, LUO Yao-jia, WEN Tao, et al     
Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Science, China Medical University Shenyang 110001, China
Abstract: Objective To observe the depression effects induced by celecoxib on gastric carcinoma BGC-823 cells proliferation induced by bFGF,to investigate the mechanism of inhibition induced by celecoxib on tumour cell proliferation. Methods After treatment of different dosages of celecoxib,expressions of COX-2,NF-B,VEGF protein in gastric carcinoma BGC-823 cells induced by 25 ng/mlbFGF were measured using western blotting. Results 25 ng/ml bFGF promoted BGC -823 cell proliferation and expressions of COX-2,NF-B,VEGF protein in a time-dependence way by PKB signal transduction(P<0.01).Celecoxib with different concentrations had proliferation-inhibiting effect on BGC-823 cell and induced apoptosis.Different dosages of celecox ib had depressant effects on the expressions of COX-2,N F-B,VEGF protein in BGC-823 cell induced by 25 ng/ml bFGF(P<0.01). Conclusion celecoxib had determinate depressant effects on gastric carcinoma BGC-823 cells proliferation induced by bF GF.
Key words: celecoxib     BGC-823 cell     bFGF     proliferation    

碱性成纤维胞因子(bFGF)是对多种细胞的增殖、分化，存活以及功能具有强烈调节作用的多肽，通过与碱性成纤维细胞生长因子受体(FGFR)结合实现其生物活性。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)蛋白激酶B(PKB)信号途径独立于促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)等，与细胞代谢、生长、凋亡和恶变紧密相关[1]。非甾体抗炎体抗炎药(NSAIDs)可降低胃肠道肿瘤发生的危险性，成为近年来肿瘤防治领域的又一研究热点[2]。塞来希布是非甾体抗炎药的一种，是第一个用于治疗类风湿关节炎和风湿关节炎的选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂。本研究观察塞来希布对bFGF促进BGC-823胃癌细胞增殖的影响，探讨塞来希布抑制肿瘤细胞增殖的机制。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 1.1.1 仪器

CO2培养箱(Binder GmbH Bergstr)；超净工作台(苏州净化设备厂)；生物倒置显微镜(日本欧林巴斯光学株式会社)；超声粉碎机、电子分析天平(瑞士Mettler公司)；低温高速离心机(德国Sigma公司)；普通离心机(北京医用离心机厂)；电泳仪(美国BIO-RAD公司)；水浴式电转印槽(北京六一仪器厂）；微量可调移液器(美国Gilson、Fisher公司)；细胞培养瓶(美国Costar公司)。

1.1.2 试剂

塞来希布(美国辉瑞公司);bFGF(北京双鹭药业);COX-2、血管内皮生长因子(VEGF)、核转录因子-B(B(NF-B)单克隆抗体(美国Santa cruz公司)；胎牛血清培养液(DMEM)(美国Sigma公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、二抗、增强化学发光试剂盒(ECL)(北京中山公司)。其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 细胞系

人胃癌BGC-823细胞株(中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学研究室)。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养

BGC-823细胞在含10％胎牛血清，50l/L庆大霉素的DMEM培养液中，37℃，饱和湿度及5%CO2的孵育箱内传代培养。

1.2.2 细胞处理方法

将对数生长期细胞1×105个／ml，接种于培养瓶，待达到70％融合时换成无血清DMEM培养液过夜，然后随机分组施加处理因素。PKB抑制剂(wortmannin)预处理：终浓度为100nmol/L的二甲基亚砜溶液孵育1h，然后加bFGF。塞来希布用二甲基亚砜溶解后配成1mol／L的储备液，实验时用无血清的DMEM稀释至所需浓度。

1.2.3 蛋白印迹(Westernblot)分析

-70℃保存的细胞样品取出，融化，每份样品加入粉碎缓冲液200l超声粉碎，4℃，12000g,离心1h，取上清。蛋白定量采用酚试剂定量法(Lowery法)。取各组细胞35g,总蛋白上样于10％十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰氨凝胶电泳分离后，电转移至硝酸纤维膜上，转印膜在封闭液(5％的脱脂奶粉溶液)中封闭过夜。加入一抗，孵育2h，洗膜，加入羊抗鼠辣根过氧化物酶标二抗，孵育1 h，Tween20-Tris缓冲液(TTBS)洗2次，Tris缓冲液洗1次。ECL按0.125ml/cm2膜面积点于转印膜上，室温孵育1min，倾掉ECL，保鲜膜覆盖后置暗盒中曝光。X光扫描成像，经凝胶自动分析成像系统和Image J图像分析软件对图中印迹区带进行定量分析。

1.2.4 实验分组蛋白印迹(Westernblot)分析

（1）分为对照，3h,6h，12h,24h、蛋白表达最大值时间点和wortmannin等6组，均由bFGF作用。(2)加入wortmannin和塞来希布Western blot分析分为对照，bFGF组，bFGF+wortmannin组，bFGF+25mol/L塞来希布组，bFGF+50mol/L塞来希布组等5组，分别取蛋白表达量最大值时间点。

1.3 统计分析

采用SPSS11.0统计软件进行方差分析和q检验。

2 结果 2.1 加入bFGF后Westernblot分析(表 1，图 1)

bFGF能时效地诱导BGC-823细胞的COX-2、NF-KB、VEGF蛋白表达量增加。其中COX-2在24h、NF-kB在12h和VEGF在24h分别表达量达到高峰，各bFGF作用时间点与对照比较差异有统计学意义(P＜0.01)，bFGF处理后与wortmannin预处理后加bFGF处理相同时间比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表 1 bFGF处理不同组别中NF-B、COX-2、VEGF表达情况( x±s)

图 1 加入FGF不同时间前Western blot分析结果

2.2 加入wortmannin和塞来希布Westernblot分析结果(表 2，图 2)

加入wortmannin和50mol/L的塞来希布后，western blot分析结果可见，COX-2NF-B、VEGF蛋白表达水平依次逐渐降低。其中bFGF组，bFGF+wortmannin组，bFGF+25和50mol/L塞来希布组与对照比较差异有统计学意义(P＜0.05)。bFGF+wortmannin组，bFGF+25和50mol／L塞来希布组与bFGF组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。bFGF+25和50mol/L塞来希布组与bFGF+wortmannin组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。bFGF+25和50mol/L塞来希布组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表 2 不同处理组别中COX-2(24h)、NF-B(12h)、VEGF(24h)的表达情况( x±s)

注：1：对照；2：bFGF组；3：bFGF+wortmanin组；4：bFGF+25μmol/L塞来希布组；5：bFGF+50μmol/L塞来希布组。 图 2 不同组处理组别Western印迹分析结果

3 讨论

本实验经外源性bFGF刺激后BGC-823细胞中COX-2、NF-KB、VEGF表达量增加之间成正相关，表达量可以被PKB抑制剂wortmannin所抑制，提示bFGF可以通过(PKB)细胞信号转导途径来促进COX-2、NF-B、VEGF的表达。可能途径为，经bFGF刺激活化的PKB引起IB磷酸化,NF-B水平提高进而上调COX-2表达。活化的PKB通过上调COX-2促进VEGF的表达。

塞来希布的作用靶点为环氧合酶，其经COX-2途径可能通过以下方面抑制肿瘤的发生：(1)抑制血管的发生(减弱bFGF的表达）；(2)促进凋亡(通过降低PKB酶活性)[3]。本实验结果显示，bFGF可以促进BGC-823细胞中NF-B、COX-2、VEGF表达量的增加且NF-B、COX-2、VEGF之间表达量有相关性。25g/ml bFGF+wortmannin组和加25，50mol／L塞来希布组与25ng／ml bFGF组比较COX-2、NF-B、VEGF表达量依次降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；且呈相关性(r=0.98，P＜0.05)。推测产生这种结果的原因可能是由于塞来希布抑制了BGC-823细胞中bFGF的生物活性，同时减弱了PKB酶活性。

研究显示，塞来希布除了COX-2途径外，还可以通过包括抑制NF-B在内的许多非COX-2依赖性途径发挥抗肿瘤作用[4]。本实验中经塞来希布处理后BGC-823细胞中NF-B蛋白表达显著降低证实了这一点。其抑制作用机制可能与塞来希布抑制IKKβ活性、IB2磷酸化及NF-B与DNA结合能力有关[5]。

己有研究表明，选择性COX-2抑制剂可显著抑制肿瘤组织的血管生成[6]，而COX-2和VEGF的表达显著相关[7]。因此，塞来希布可能通过抑制bFGF的活性、PKB酶活性、NF-B和COX-2的表达，进而调节VEGF的分泌从而影响胃癌的生成和发展及预后。

参考文献
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