中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (5): 519-521   PDF    
引用本文
王路, 杨志平, 崔洪斌. 植酸对IkB-α表达及胃癌细胞增殖抑制作用[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(5): 519-521.
WANG Lu, YANG Zhi-ping, CUI Hong-bin Effect of phytic acid on expressions of gene IkB-α and growth of gastric carcinoma cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(5): 519-521.
植酸对IkB-α表达及胃癌细胞增殖抑制作用
王路1, 杨志平2, 崔洪斌2     
1. 哈尔滨工业大学食品科学与工程学院, 哈尔滨150090;
2. 哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室
收稿日期: 2007-08-16
基金项目: 国家自然科学基金项目(30471446)
作者简介: 王路(1973- ),女,黑龙江哈尔滨人,讲师,博士,研究方向:植物化学生物活性。
通讯作者: 崔洪斌
摘要： 目的 研究植酸对抑制性卡巴蛋白(IkB-α)表达影响与抑制胃癌细胞增殖作用机制. 方法 采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法观察植酸对人胃癌(SGC)7901细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜下观察植酸对细胞基本生长状态及形态的影响;单细胞凝胶电泳实验观察植酸对SGC-7901细胞的凋亡诱导作用;蛋白印迹法(Western blot)检测凋亡相关基因IkB-α及可能相关的细胞核因子NF-kBP65蛋白表达. 结果 MTT实验结果显示,植酸对SGC-7901细胞具有生长抑制作用,并呈现剂量-时间效应关系;不同浓度的植酸对人SGC-7901 3 d时抑制率分别为26.35%,53.20%,69.29%,86.65%和93.61%.倒置显微镜下的形态学观察表明,加药组细胞的生长状态不佳,植酸作用组细胞出现典型凋亡的彗星脱尾,且存在剂量效应关系,不同浓度的植酸对人SGC-7901 DNA损伤率分别为5.9%,11.0%,34.6%和63.1%.植酸能够上调IkB-α蛋白的表达,植酸处理组细胞中IkB-α蛋白比对照组表达升高,且均呈现剂量-反应关系;同时,植酸能够下调NF-kBP65的蛋白表达. 结论 植酸对胃癌SGC-7901细胞具有抑制增殖作用,IkB-α参与了植酸对人胃癌SGC-7901细胞的凋亡诱导作用机制.
关键词： 植酸     增殖抑制     抑制性卡巴蛋白(IkB-α)     胃癌    
Effect of phytic acid on expressions of gene IkB-α and growth of gastric carcinoma cells
WANG Lu, YANG Zhi-ping, CUI Hong-bin     
Institute of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology Harbin 150090, China
Abstract: Objective To explore the effect of phytic acid on apoptosis of gastric carcinoma cells and mechanisms of proliferatory inhibition. Methods The inhibiting action of phytic acid on SGC-7901 cells were examined by MTT assay.The effect of IP6 on mor phology alterations of SG C-7901 cells by reverse discrepancy microscope observation and the effect on apoptosis of SGC-7901 cells was examined by Comet Assay,and the expressions of IkB-and NF-kBP65 protein were detected by Western blot method. Results From MTT assay,phytic acid was observed with the inhibition on the growth of gastric cells in dose and time dependent manners,the rate of cell growth suppression was 26.35%,53.20%,69.29%,86.65% and 93.61% at different concentrations,respectively.Cell growth of dosage group was inhibited.Rate of DNA tail of experimental groups was significantly higher than that of control group,and the rate of DNA damage was 5.9%,11.0%,34.6% and 63.1%.The expressions of IkB-α protein in phyt ic acid group were higher compared with control group,and increased in a dose-dependent manner.Expr essions of NF-kBP65 protein in phytic acid group was lower compared with control group,and reduced in a dose-dependent manner. Conclusion Phytic acid can inhibitit the proliferation of gastric carcinoma SGC-7901 cells which may be correlated to apoptosis associated gene IkB-α.
Key words: phytic acid     proliferatory inhibition     IkB-α     g astric carcino macells    

植酸(phytic acid，IP6，肌醇六磷酸)主要存在于豆类和谷类植物体中，具有天然生物活性成分物质，是一种抗营养因子[1]。有资料表明[2]，植酸具有预防和治疗多种肿瘤的药用活性，且天然低毒，已成为抗肿瘤新药研究与开发的热点。本研究以人胃癌(SGC)7901细胞株为离体实验模型，探讨植酸对抑制性卡巴蛋白(IkB-)表达影响及胃癌细胞增殖的抑制作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 人胃癌细胞株

SGC-7901细胞(北京市肿瘤研究所)。细胞培养于含10％国产优级胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％双抗的RPMI1640培养液中，置于37℃、5％CO2孵育箱中，用0.02％的乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)进行传代培养。

1.1.2 试剂

RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；植酸(50％水溶液)(美国Sigma公司)，用无菌去离子水配成储存液(100×)，临用时用2％培养液稀释成终浓度为0，2.0，2.5利3.0mmol／L作用于细胞；鼠抗人P65单克隆抗体与兔抗人β-actin、抑制性卡巴蛋白(IkB-)多克隆抗体(美国Santa Cruz生物技术公司，北京中杉生物技术公司)；碱性磷酸酶标记抗兔与抗鼠IgG(美国Pregema公司)。

1.2 方法 1.2.1 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)实验

常规培养SGC-7901细胞，选择指数生长期细胞，用乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)消化，调整细胞数为2.5×104／ml，接种于96孔培养板，每孔200l，实验组分别给予终浓度为1.5，2.0，2.5，3.0，3.5mmol／L的植酸，对照组加入等量的新鲜培养液，每个剂量组设5个平行孔。分别培养24，48和72h后加入浓度为5g／L的MTT液20l，继续培养4h，吸弃上清，加入150l二甲基亚砜(DMSO)在平板摇床微振荡10min，于酶标仪上490nm波长处测定各孔的吸光度(A)值，计算植酸对SGC-7901细胞的生长抑制率。

1.2.2 倒置显微镜下形态学观察

将终浓度为3.0mmol/L植酸的2％胎牛血清的RPMI-1640完全培养液，及不含植酸的2％胎牛血清的RPMI-1640完全培养液作为空白对照液，培养24h后，倒置显微镜观察细胞形态变化。

1.2.3 单细胞凝胶电泳实验

用100l磷酸盐缓冲液(PBS)配制0.8％正常溶点凝胶，沸水溶解，载玻片上于4℃固化5min。浓度分别为0，2.0，2.5和3.0mmol／L的植酸作用SGC-7901细胞48h后的细胞悬液，取10l在37℃与90l低溶点胶混合加到第一层胶上，4℃固化10min后，浸没于裂解液中，4℃解1h。蒸馏水洗后，水平移入电泳槽，避光静止解旋20min。25V电压电泳20min。用2.4mol／L三羟基氨基甲烷(Tris，pH 7.5)漂洗3次后滴加5g／ml溴化乙锭(EB)30l，24h内阅片，观察不同浓度植酸对DNA的损伤影响。

1.2.4 蛋白印迹(Westernblot)检测

常规收集同一时间点不同浓度的细胞，加细胞裂解液，提取蛋白质并测其浓度(Bradford法)。蛋白提取液变性，进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质。再将其转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，0.1％牛血清白蛋白(BSA)封闭1h后，用相应的一抗(2h)、二抗(1h)在杂交箱内反应。用碱性磷酸酶显色后在凝胶数字成像仪上拍照。

1.3 统计分析

采用SPSS 13.0软件进行分析。

2 结果 2.1 MTT测定结果(表 1)

用不同浓度的植酸作用于SGC-7901细胞，根据MTF法用酶标仪住490mm波长下检测细胞的吸光度(A)，连续检测3d，用各剂量组的平均吸光度(A)值表示细胞的增殖情况，植酸作用下计算出细胞的生长抑制率。植酸对SGC-7901细胞有生长抑制作用，在每个时间点，随着植酸浓度的增加，细胞增殖速度均减缓，植酸对细胞增殖的抑制率均增加，其对细胞生长的抑制作用呈现剂量-效应关系；对于每个剂量组，随着时间的延长，植酸对细胞的增殖抑制率也逐渐增加，呈现时间-效应关系，当植酸浓度达到3.5mmol／L时，细胞基本停止生长。

表 1 不同浓度植酸、不同时间对胃癌SGC-7901细胞的生长抑制率( mmol/ L,%)

2.2 植酸对SGC-7901细胞形态学的影响(图 1)

分别用浓度为0和3.0mmol／L的植酸处理细胞24h，在倒置显微镜下观察细胞基本生长状态的改变及形态的变化。

图 1 植酸(IP6)作用SGC-7901细胞24h的细胞形态

2.3 单细胞凝胶电泳实验检测植酸对DNA损伤的影响

荧光显微镜下可见，对照组细胞DNA呈圆形，边界清晰；植酸作用组细胞DNA呈现由圆形、致密红色核心(彗头)和朝向阳极的尾端DNA碎片(彗尾)构成的彗星形状。植酸(IP6)作用SGC-7901细胞48h，浓度分别为0，2.0，2.5和3.0mmol／L，DNA损伤率分别为5.9％，11.0％，34.6％和63.1％。随着植酸作用浓度的增加，细胞的彗星拖尾率也逐渐增大，呈现剂量-反应关系(P<0.05)。

2.4 蛋白印迹检测IkB-、NF-kBP65蛋白表达结果(图 2，3)

植酸(IP6)作用胃癌细胞36h，IkB-蛋白表达随着IP6剂量的增加而呈递增趋势(数字成像仪上密度扫描值分别为0.790，0.805，0.885，0.930)。植酸(IP6)作用胃癌细胞72h，NF-kBP65蛋白表达随着IP6剂量的增加而呈递减趋势(数字成像仪上密度扫描值分别为0.521，0.493，0.450，0.256)。

图 2 植酸(IP6)作用SGC-7901细胞36h的IkB-蛋白表达

图 3 植酸(IP6)作用SGC-7901细胞72h的P65蛋白表达

3 讨论

MTT法测定结果表明，植酸对人胃癌SGC-7901细胞增殖具有抑制作用，呈剂量依赖性和时间依赖性。通过形态学和生化研究方法观察到细胞凋亡所具有的典型特征改变，证明植酸能够引起人胃癌SGC-7901细胞DNA损伤，诱导细胞凋亡的发生。

IkB-是IkB家族中的重要一员，细胞在静息状态下，存在于胞浆中，含有1个30～33氦基酸重要序列(锚蛋白重复区，ARM)[3-5]，与细胞核因子(NF-kB)[4, 5]的Rel同源区(RHD)发生作用，覆盖NF-kB亚基P65的核定位序列(NLS)，与NF-kB的二聚体组成三聚体，并使之滞留于胞质中，从而阻止NF-kB进入胞核与目标基因启动区域的特定序列结合，而处于无活性状态。当细胞受到外源性刺激时，IkB迅速裂解，NF-kB被激活并从三聚体中释放出来，借助于暴露出来的核定位信号进入细胞核，可调控与炎症、细胞增殖及凋亡等效应相关基因的转录，促进蛋白合成[6, 7]。本研究结果显示，植酸作用组IkB-蛋白的表达比正常对照组高，NF-kBP65蛋白的表达均比正常对照组低，呈剂量-反应关系。结果提示，植酸可能通过诱导IkB-的表达而抑制NF-kB信号传导通路的传导进而抑制下游基因的表达，从而促进细胞的凋亡。

综上所述，植酸在诱导SGC-7901细胞凋亡过程中，NF-kB的抑制因子IkB-活性增强，进而抑制核转录因子NF-kB的表达，可能会抑制下游凋亡抑制基因的表达，启动细胞的凋亡。细胞凋亡是一个程序化的复杂生理过程，它的启动和发展需要多种基因及其产物的参与。植酸是否通过其他信号传导通路启动细胞的凋亡尚需进一步研究。

参考文献
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