2008, Vol. 24
2. 南方医科大学附属珠江医院;
3. 南方医科大学分子生物学院
布鲁菌是布鲁菌病的病原体，传统方法是根据培养生物特性、氧化代谢和抗原特征、噬菌体裂解特点以及主要宿主的不同，将布鲁菌分为6个生物种19个生物型。但传统分型方法操作繁琐，耗时较长，因而有其局限性。细菌染色体DNA的酶切脉冲场凝胶电泳方法（pulse-field gel electrophoresis,PFGE）能够对整个染色体进行分析，稳定性好，分辨率高，已成为许多细菌分型、调查细菌菌株间遗传关系的可靠方法[1, 2]。我们挑选国内不同时限、不同地点分离的95株布鲁菌(包括19株标准菌株)，进行脉冲场凝胶电泳图谱分析。结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 菌株来源本实验选用布鲁菌属的各种、生物型菌株的代表菌株19株； 1955～2004年自我国19个省份分离到的76株布鲁菌属菌株（羊种40株、牛种21株、猪种7株、犬种7株、绵羊附睾种菌株1株），参考菌株为沙门菌Braenderup血清型全球参考菌株H9812(均由中国疾病预防控制中心保存、复苏及鉴定)。
1.2 仪器及试剂脉冲场凝胶电泳仪（美国Bio-Rad公司），凝胶影像分析系统GEL DOC2000（美国Bio-Rad公司），XbaI核酸内切酶（美国Promega公司），SeaKem Gold琼脂糖（美国CamBreX公司），脉冲场凝胶电泳(PFGE)级琼脂糖（美国Bio-Rad公司）。
1.3 方法 1.3.1 布鲁菌分类鉴定按国际标准操作方法进行[3]，略有改动。限制性内切酶：XbaI；电泳缓冲液：0.5×TBE；温度：37℃；电场夹角：120°；电压梯度：6V/cm；脉冲时间：2～25s；电泳时间：18 h。
1.3.2 聚类分析根据杂交图谱带型，用Bionumerics软件中Band comparision的Dice距离算法，通过两两比较PFGE结果中的条带数量和位置，进行树状图自动生成。
2 结果 2.1 标准菌株的PFGE基因组分型电泳图谱（图 1）通过PFGE电泳，布菌6种菌的标准株各有不同的电泳图谱，羊种菌1、2、3型，牛种菌1、2、5型和猪种菌1、2、3、5型均可在各自种内被区别，但是牛种1、4型，5、6、9型及2、3型菌各自有相同的PFGE图谱，猪种2、4型菌有相同的电泳图谱。
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注：H.沙门菌Braenderup血清型全球参考菌株H9812；1：布鲁菌羊种1型标准株；2：布鲁菌牛种1型标准株；3：布鲁菌猪种1型标准株；4：布鲁菌犬种标准株；5：布鲁菌绵羊附睾种标准株；6：布鲁菌沙林鼠种标准株；7，8：布鲁菌牛种2型标准株；9：布鲁菌牛种3型标准株；10：布鲁菌牛种4型标准株；11：布鲁菌牛种6型标准株；12：布鲁菌牛种7型标准株；13：布鲁菌牛种9型标准株；14：布鲁菌牛种5型标准株；15：布鲁菌羊种1型标准株；16：布鲁菌羊种2型标准株；17：布鲁菌羊种3型标准株；18：布鲁菌猪种2型标准株；19：布鲁菌猪种3型标准株；20：布鲁菌猪种4型标准株；21：布鲁菌猪种5型标准株。 图 1 布鲁菌19株标准菌株的PFGE图谱 |
2.2 标准菌株的相似性关系
从系统发生的观点看，羊、牛、猪、绵羊附睾种菌是从共同祖先进化来的，犬种菌可认为是猪种菌的主要株或是刚从该种布菌进化而来的株。但沙门菌的PFGE图谱将自己与布菌各种均能区别开。
2.3 中国分离菌株的PFGE基因组分型电泳XbaI对布鲁菌染色体DNA进行酶切后，可产生15～25条DNA片断，其范围从20～500kb。76株布鲁菌中最高相似性100%，最低相似性80%。本研究中的76株布鲁菌的野生分离株的PFGE图谱显示，羊种菌在400和200 kb处各有一条特征性条带，猪种菌在220和190 kb处各有一条特征性条带，对于牛种菌来讲，部分牛种菌与猪种菌相似，在约220和190 kb处各有一条特征性条带，剩余牛种菌则在400，220和167 kb处各有一条特征性条带。138～20.5 kb区间，集中了大部分的酶切片段，而且相似程度非常高。
2.4 中国分离菌株的相似性关系PFGE聚类结果显示，大体上是羊种菌聚为一类，牛种菌聚为一类，猪种菌聚为一类，犬种菌聚为一类，而每一类又都有例外，并不是互相排斥的关系。树状图显示，被研究的76株布鲁菌中国分离株可以被分为39种PFGE类型。所有的PFGE类型的图谱都很相似，只有很少条带表现出差异。在这39种PFGE类型中，只有7种类型包含了至少3株分离菌，类型1 是主要的PFGE型，19株布鲁菌属于该类型。接下来是类型5和类型25 ，分别有5株和6株布鲁菌属于该类型。
PFGE类型和地理来源没有很明显的关联，同一个省区的布鲁菌分离株可被分为不同的PFGE类型，不同省份的布鲁菌分离株可以属于同一种PFGE类型。
3 讨论初步建立了布鲁菌PFGE研究的较为合适的体系。将该体系应用于布鲁菌19标准菌株的分型研究，发现PFGE可以在种的水平上区分布菌各种，有些种内的不同生物型也可被区分开。聚类分析和树状图也表明，从系统发生的观点来看，羊、牛、猪、绵羊附睾种菌是从共同祖先进化来的，犬种菌可认为是猪种菌的主要株或是刚从该种布菌进化而来的株。
本研究所选择的76株布鲁菌分离菌株猪种菌在220和190 kb处各有一条特征性条带；对于牛种菌来讲，部分牛种菌与猪种菌相似，在约220和190 kb处各有一条特征性条带，剩余牛种菌则在400，220和167 kb处各有一条特征性条带。聚类分析和树状图表明，76株布鲁菌中国分离株可以被分为39种PFGE类型，可被聚为四个大类。PFGE分型方法与传统的分型方法比较，二者的一致性高达63%。
本研究的结果表明，可引起脉冲场电泳核型变化的突变很多，PFGE核型结果与传统分型结果相近，可以作为传统分型的一种补充，揭示菌株间的亲缘关系，个体差异则说明同一型的布鲁菌，在不同的生存环境中，受环境因素的影响而发生遗传变异，经过长期的演变，形成与原来菌株有差异的新的基因菌型。
| [1] | Allardel-servent A N, Bouziges M J, Carles-Nurit, et al. Use of low-frequence cleavage restriction endonucleases in epidemiological investigations of nosocomial bacterial infections[J]. J Clin Microbiol, 1989, 27 : 2057–2061. |
| [2] | Thong K L, Y M Cheong, S Puthucheary, et al. Epidemiological analysis of sporadic Salmonella typhi isolates and those from outbreaks by pulsed-field gel electrophoresis[J]. J Clin Microbiol, 1994, 32 : 1135–1141. |
| [3] | Lewis MG, Bala S. Pulsenet standardized protocol for subtyping Listeria monocytogenes by macrorestriction and pulsed-field gel electrophoresis[J]. Food Microbiol, 2001, 65 : 55–62. DOI:10.1016/S0168-1605(00)00501-8 |