2008, Vol. 24
汉坦病毒(HV)是人类重要的致病病毒，在临床上引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒肺综合征(HPS)，对人类健康造成很大的威胁。包膜糖蛋白(glycoprotein，GP)是HV的主要结构蛋白，GP分子上存在着中和抗原位点、血凝抗原位点、细胞融合位点等，具有良好的免疫原性，可刺激机体产生中和抗体，是设计新型疫苗的首选靶点。
细胞融合是包括HV在内的许多包膜病毒侵入细胞、复制、释放、传播和致病的重要生物过程，也是细胞间信息传递的重要步骤，是决定病毒毒力的重要因素。因此，明确HV的细胞融合机制，尤其是精确的细胞融合活性位点功能定位，对更有效地研制新型疫苗和治疗制剂，用于HFRS、HPS的预防和治疗具有重要意义。本文研究对HV GP的细胞融合活性进展作一综述。
1 HV GP细胞融合活性的特点20世纪80～90年代，有学者报道，感染HFRS相关的HV(如汉滩病毒、汉城病毒、普马拉病毒)的组织培养细胞在低pH条件下可发生细胞融合[1]。一般说来，在内体(endosome)的酸性环境中，包膜病毒的包膜能与内体膜融合，导致低pH依赖性的感染细胞的融合，这一过程是通过GP介导的[2]。2004年，日本学者[3]又为GP作为融合原(fusogen)提供了更为直接的试验证据。2007年国内学者Zheng F等[4]也通过试验发现GP能独立地介导细胞与细胞之间的融合。经研究发现，HV GP细胞融合活性的表现有以下特点。
1.1 pH依赖性包膜病毒与膜的融合方式分为2类：非pH依赖型和pH依赖型。非pH依赖型，它在中性pH下即可发生融合，病毒包膜直接与靶细胞膜融合，将病毒粒子释放至细胞内；pH依赖型，只有在pH为5～6的条件下才能发生融合，病毒先以受体介导的内吞方式进入细胞后，存在于内体中，然后在内体低pH环境下触发融合。以上2种情况都需要通过病毒包膜上的特异糖蛋白来介导。目前学者一致认为HV致细胞融合为pH依赖型。最早在1985年，Arikawa J等就发现HV在pH为4.9～6.3的条件下方能诱导细胞发生融合。Ogino M等[3]也通过试验证实，感染的Vero E6细胞只在低pH(pH为5.8) 条件下形成合胞体，而在中性pH时不能发生融合。同时，转染表达GP的重组子Vero E6细胞亦必须经过低pH处理才能形成合胞体。这是因为较低的pH可使病毒包膜糖蛋白发生不可逆的构象变化，并改变病毒粒子和细胞表面的基团电荷，从而促进病毒包膜糖蛋白与细胞表面受体的结合，引起细胞融合。
1.2 细胞系依赖性Ogino M等[3]检测了汉滩病毒(HTNV)感染不同的细胞系后细胞融合的发生情况，所有的细胞系都用0.1 MOI(multiplicity of infection)的病毒量感染，培养8d后检测，发现只有传代5次以内的Vero E6细胞发生了低pH依赖性的细胞融合，而传代超过150次的Vero E6细胞中未见合胞体。另外，病毒感染的BHK-21、P388D1细胞中亦未见合胞体形成。这些结果表明，除了定位于细胞表面的GP外，某些宿主因素同样是HTNV诱导细胞融合所必不可少的。这一特点对于解释HV对人类及储存宿主啮齿动物的致病性不同提供了一定依据。
1.3 形态学特点Ogino M等[3]通过用不同的荧光标记物标记HTNV感染的(绿色)与未感染的(红色)Vero E6细胞，将它们共同培养，经低pH处理后，可见从淡红黄色(reddish yellow)到淡绿黄色(greenish yellow)不等的合胞体，合胞体的颜色反映了发生融合感染的与未感染细胞的比例。说明HTNV感染的Vero E6细胞与感染及未被感染的细胞均能发生融合。
2 糖基化对细胞融合的影响HV Gn和Gc都是典型的糖蛋白，分别带有各自的信号肽序列。Shi X等[5]认为Gc的信号肽序列是Gn胞质尾的必不可少的组成部分，同时是Gn和Gc转移到高尔基复合体进而进行完全糖基化所必需的。同该科中其他病毒一样，HTNV包膜糖蛋白Gn和Gc形成一种异二聚体，聚集在高尔基复合体中，然后病毒装配成熟并释放[6]。所以，Gn和Gc的异二聚体化是它们正确折叠并转运至高尔基复合体的前提[5]，同时也是发挥细胞融合活性的前提。
2.1 糖基化的位置与功能HV Gn和Gc蛋白都是N-连糖基化修饰的，有6个潜在的N-连糖基化位点，其中5个在Gn上(N134、N235、N347、N399、N609) ，一个在Gc上(N928) 。N-连糖基化不仅对蛋白的正确折叠十分重要，而且与病毒GP的许多功能相关[7-9]，如结合受体、介导膜融合和病毒进入细胞、引导病毒在出芽部位的形态发育、作为抗原引发保护性免疫反应等。Shi X等[10]证实N-连接的寡糖链均为高甘露糖型，他们用基因定点突变技术构建了6个N-连糖基化位点突变体及4个双位点突变体，发现Gn上的4个位点(N134、N235、N347、N399) 和Gc上的一个位点(N928) 被利用而被糖基化，而Gn位于胞质内的一个位点(N609) 未被利用。
2.2 糖基化程度对细胞融合的影响N-连寡糖链可以在很多方面影响蛋白的功能，如促进它们正确折叠、维持蛋白的构型和稳定性、保护蛋白免受蛋白溶解作用、调控蛋白的生物学活性。已有报道显示某些病毒融合蛋白的寡糖链缺失可使病毒的细胞融合功能缺陷或丢失[11, 12]。Zheng F等[13]克隆HTNV包膜糖蛋白cDNA并在Vero E6细胞中进行表达，采用N-连糖基化定点突变技术分析特定的寡糖链的作用，发现N134A突变株不能在细胞表面表达Gn而只表达Gc，由于Gn、Gc单独表达时仅滞留在内质网而不能转运至细胞表面[9]，所以他们未发现该突变株所致的细胞融合。而Gn其它糖基化位点的突变株(N235、N347、N399) 对细胞融合没有明显的影响。与之相反，Gc糖基化位点(N928) 的突变不能引起细胞融合的发生。同时，他们将Gn中的一个位点(N235A、N347A或N399A)及Gc上位点(N928A)同时突变。结果，细胞同Gc上单个位点突变时的表现一致，证实Gc上N928位的N-连寡糖链缺失足以阻止细胞融合的发生。
3 HV GP细胞融合活性的发生机制一般认为，在内体的酸性环境中，包膜病毒粒子表面发生不可逆的形态学改变，原有的蛋白复合体(native protein complex)分离，融合蛋白同源三聚体(homotrimer)形成，以利于更稳定的插入膜中[14]，最终导致细胞融合发生。
3.1 融合蛋白的定位对于HV GP融合活性位点的定位，现有的大多是计算机程序的分析预测数据。Ogino M[3]等采用SOSUI程序分析，发现Gn有5个疏水区，认为HV的融合肽(fusion peptide)存在于其中一个疏水区内。而Garry CE[15]等对布尼亚病毒包膜糖蛋白采用蛋白质组学的计算机分析方法，认为HV的融合肽是Gc的一段氨基酸序列：WGCNPSDCPGVGTGCTACGLYLD。Tischler ND等[16]用计算机分析及分子模拟等方法研究发现，HV及布尼亚病毒科其他成员的Gc蛋白能引发细胞融合。
2007年，Zheng F等[13]采用N-连糖基化定点突变技术研究发现，Gc上N928位的N-连寡糖链缺失足以阻止细胞融合的发生，而Gn上除了N134外各糖基化位点的突变对细胞融合都没有明显的影响，从而证实HV的融合蛋白位于Gc而不是Gn上，这为融合蛋白的粗略定位提供了直接的试验依据。
3.2 融合蛋白的定性病毒融合蛋白有两类，分别称为I类和II类融合蛋白。它们的融合肽具有某些共同的物理-化学及拓扑学特点，如高度的序列保守性、长度为15～25个残基、富含Gly残基、定位于包膜蛋白的胞外结构域[17]。同时它们又具有各自不同的特点。I类融合蛋白的共同特征是在位于N端的融合单位附近有一个三聚体形式的coiled-coil折叠，由α螺旋的氨基酸组成[18]，如流感病毒的血凝素、HIV的gp41、副粘病毒F蛋白、Ebola病毒GP2等。而II类融合蛋白含3个由反向平行的β片层结构组成的结构域，融合肽位于分子内部，是一个环形结构，2个β片层组成其侧翼[19]。己知的II类融合蛋白包括α病毒属SFV(Semliki Forest virgs)E1蛋白，黄病毒属TBEV(tick-borne encephalitis virus)、登革病毒、西尼罗病毒E蛋白等。
Garry CE等[15]借助蛋白质组学计算机分析技术揭示布尼亚病毒科病毒的Gc蛋白为II类融合蛋白，布尼亚病毒科各属病毒的Gc具有与其它已知的II类融合蛋白相似的特性，如分子内部的融合肽、C端的跨膜结构域、与脂质双层膜的高度亲和性等。Tischler ND等[16]也发现HV Gc表现出与II类融合蛋白甲病毒属E1及黄病毒属E蛋白相似的序列特征，并根据TBEV E蛋白结晶学资料构建了ANDV(Andes virus)Gc胞外结构域的三维分子模型，也支持II类融合蛋白的折叠特征。他们还用荧光各向异性实验分析Gc中可能的融合肽区域与人工胞质膜的结合活性。上述所有结果都支持HV Gc属II类融合蛋白，其融合肽区域可能是ANDV Gc第115～129位氨基酸残基。
为了确定HV可能的融合肽区域在细胞融合中的作用，还需要有进一步的更直接的证据，如利用基因定点突变技术将可能的融合肽区域进行突变，然后检测突变前后细胞融合活性的变化情况。
4 展望HFRS是由HV引起的急性自然疫源性疾病，目前临床尚缺乏特异有效的治疗药物，疫苗的使用是防治本病的重要手段[20]。20世纪90年代初开始，我国人群中开始接种HV灭活疫苗，在控制HFRS疫情中发挥了重要作用。HV灭活疫苗具有安全性好的优点，但免疫原性弱，不能诱导细胞免疫和粘膜免疫的产生，而后者对于预防HV感染十分重要。因为HFRS病人多通过吸入被HV污染的气溶胶而感染。减毒活疫苗免疫原性强，可诱导产生体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，但至今尚未研制成功。亚单位疫苗不含病毒核酸，只含病毒蛋白质，故其免疫原性仍然保留，且非常安全，可供孕妇使用，但亦未研制成功。
如果能确定HV的入侵细胞机制，从而针对性地改变它的基因，改变它的表达产物及其生物学活性，从而可消除或降低HV的致病性。另一方面，也可以通过改变HV的细胞侵入、复制等特性，消除或减少感染HV的危险性。融合蛋白介导的细胞融合是包膜病毒侵入宿主细胞的最为重要的步骤，这一过程的阐明对于研制更安全有效的HV减毒活疫苗和新型基因工程疫苗(基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等)和特异性抗病毒的多肽类药物、预防和治疗HV感染具有重要意义。所以，对HV融合肽的精确定位及HV细胞融合模型的构建将是今后基础研究的重要内容。
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