目前，化妆品中滥用抗生素的情况时有发生，人体长期接触含抗生素成分的化妆品后，药物不断在体内蓄积，当浓度达到一定量后，就会对人体产生毒性作用。四环素类药物的毒性反应主要表现为对胃、肠、肝脏的损害及牙齿的染色等。还会造成过敏反应，二重感染，致畸胎作用。而氯霉素有严重的副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，对人类的健康构成潜在的危害。目前化妆品中土霉素、四环素、金霉素、氯霉素含量的检测尚无国家标准检验方法，为此进行了本试验。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

HP1100型高效液相色谱仪(HPLC)，G1315A DAD二极管阵列检测器，G1313A ALS自动进样器；SUPELCO DISCOVERY C18 5μm 250×4.6mm色谱柱。固相萃取小柱为ZORBAXSPE C18 Cart。12头固相萃取真空富集装置。超声波清洗器KS-500D，超速离心机LD4-2。甲醇(色谱纯)；磷酸二氢钠(分析纯)乙二胺四乙酸二钠(EDTA，分析纯)，高氯酸溶液(优级纯)、硝酸(优级纯)。土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准品(美国Sigma公司)。

1.2 高效液相色谱分析条件

色谱柱为SUPELC0 Discovery C18，5μm，250×4.6mm，流动相为0.01mol/L磷酸二氢钠+0.001mol/LEDTA：甲醇=60:40,(V/V，pH=2.0) ，流速为0.8ml/min，检测波长为268nm，柱温为25℃，进样量为20μl。

1.3 方法 1.3.1 土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准储备液的配制

分别称取0.0100g土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准品置于4个10ml容量瓶中，分别加入甲醇溶解并定容至刻度，此溶液浓度分别为1.00mg/ml，置于冰箱冷藏室保存。

1.3.2 混合标准中间液的配制

分别吸取土霉素、四环素标准储备液各1.00ml，金霉素、氯霉素标准储备液各2.00ml，置于100ml容量瓶中，用流动相A液定容至刻度，溶液浓度分别为：土霉素(10μg/ml)、四环素(10μg/ml)、金霉素(20μg/ml)、氯霉素(20μg/ml)，置丁冰箱冷藏室保存。

1.3.3 标准使用液的配制

准确吸取混合标准中间液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0ml，分别置于10ml容量瓶中，用流动相A液定容至刻度，得到标准系列为：0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0μg/ml(土霉素、四环素)；0.2,0.4，1.0,2.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0μg/ml(金霉素、氯霉素)。

1.3.4 流动相A液的配制

0.01mol/L磷酸二氢钠+0.001mol/EDTA，用30%硝酸调至pH=2.0，经0.45μm双层水系滤膜过滤。

1.3.5 流动相B液的配制

0.01mol/L磷酸二氢钠，用30%硝酸调至pH=2.0，经0.45μm双层水系滤膜过滤。

1.3.6 样品前处理

准确称取1.00g样品于10ml带塞的离心管中，加入5%高氯酸溶液至刻度，搅匀，将此离心管放入超声波清洗器中提取20min后，用5%高氯酸补足到刻度，盖上塞子，置于4℃冰箱中5h，取出离心10min，吸取上清液，用0.45μm的水系滤膜过滤。

1.3.7 样品测定

吸取样品溶液20μl进样，进行HPLC分析，记录4种抗生素的峰面积。根据4种抗生素的保留时间和紫外吸收光谱图定性，峰面积定量。

2 结果 2.1 色谱分离条件的选择 2.1.1 检测波长的选择

由4种抗生素的紫外吸收光谱图可见，土霉素、四环素、金霉素在268，355nm处各有一个吸收峰，氯霉素在278nm处有一个吸收峰，分别在波长268，278和355nm下用高效液相色谱仪以4种抗生素的混合标准进行测定。结果表明，在波长268nm下，4种抗生素色谱峰分离较好且测定灵敏度明显高于278,355nm处，实际样品在此波长条件下的溶剂峰对4种抗生素的测定无影响，故选择测定波长为268nm。

2.1.2 流动相的选择 2.1.2.1 流动相配比的选择

为了有利于色谱峰的分离，选用0.01mol/L磷酸二氢钠溶液与甲醇的混合液为流动相。分别进行V_{磷酸二氢钠}:V_甲醉=70:30，65:35，60:40，55:45的试验。由色谱图可见，随着流动相中甲醇含量的增加，4种抗生素测定的灵敏度升高，保留时间减少，但色谱峰分离变差。权衡分离度和保留时间，本方法选用V_{磷酸二氢钠}:V_甲醇=60:40为流动相。实际样品在此流动相条件下的杂质峰对4种抗生素的测定无干扰。

2.1.2.2 流动相的优化(表 1)

流动相中0.001mol/LEDTA可以使分离效果更好。从表 1可见，流动相中加入EDTA二钠，提高了方法的精密度。原因是四环素类抗生素分子中含有酚羟基和烯醇基，易与二价金属结合，因而造成重现性差，流动相中加入适量EDTA可以改善这种现象。

2.2 样品前处理条件的选择

用高氯酸水溶液作为提取液是因为4种抗生素都能够溶解于水，高氯酸可沉淀化妆品中的蛋白质。用营养面霜样品分别做浓度为0.1%，2%和5%高氯酸溶液的抗生素提取试验。随着高氯酸浓度的增大，样品中的蛋白质沉淀更加完全，有利于提取液的过滤，故选取高氯酸浓度为5%。

2.3 方法的线性和最低检出浓度

用土霉素、四环素浓度分别为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0μg/ml，金霉素、氯霉素浓度分别为0.2，0.4，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0，16.0,20.0μg/ml的混合标准溶液，在规定的色谱条件下，进样20μl，进行测定，求4种抗生素的响应峰面积与浓度的线性回归方程。其回归方程及相关系数r分别为土霉素：y=56.3215x-0.9004，r=0.9999；四环素：y=42.8345x.1.1484，r=0.9999；金霉素：y=23.0097x-0.9630，r=0.9999；氯霉素：y=38.8332x+0.1655，r=0.9999。表明在该浓度范围内呈线性关系，符合定量要求。

以基线噪音的3倍计算方法的最低检出浓度，土霉素为0.36mg/kg，四环素为0.50mg/kg，金霉素为0.86mg/kg，氯霉素为0.20mg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度(表 2)

以空白面霜样品为本底，分别加入不同量的抗生素，每个样品平行测定6次。

2.5 实际样品的测定

用上述检测方法对市售101个样品进行检测。样品包括沐浴液、洗发水、护发护肤用品。101份样品中检出29份含土霉素，含量为1.7～3300mg/kg；62份含四环素，含量为1.0～2244mg/kg；7份含金霉素，含量为5.7～1272mg/kg；1份含氯霉素，含量为326mg/kg。

3 小结

通过高氯酸沉淀蛋白质、超声波提取样品的前处理方法，以及优化高效液相色谱条件，对化妆品中土霉素、四环素、金霉素、氯霉素4种抗生素残留进行同时测定。实验结果表明，该方法测定灵敏度高、稳定性好、简便易行，4种被测组分色谱分离效果好。