中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (4): 476-478   PDF    
引用本文
王艳芳, 梁卫华, 郝卫, 潘玉先, 车小燕. 曲霉抗原双抗体夹心ELISA法特异性检测[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(4): 476-478.
WANG Yan-fang, LIANG Wei-hua, HAO Wei, et al. Study of double monoclonal antibody sandwich ELISA in detection of Aspergillus specific antigen[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(4): 476-478.
曲霉抗原双抗体夹心ELISA法特异性检测
王艳芳, 梁卫华, 郝卫, 潘玉先, 车小燕     
南方医科大学珠江医院临床医学基础研究所 广州 510282
收稿日期: 2007-08-08
作者简介: 王艳芳(1981- ),女,山东人,硕士在读,研究方向:抗体工程、感染与免疫。
摘要： 目的 用2组曲霉单克隆抗体(mAbs)建立特异性识别不同种类曲霉抗原的检测方法。 方法 采用天然烟曲霉抗原免疫,获得广谱针对曲霉抗原的单克隆抗体;采用重组烟曲霉抗原获得特异性针对烟曲霉抗原的单克隆抗体,用间接免疫荧光鉴定,并分别建立2种双抗体夹心ELISA法,对19种常见的环境和临床分离曲霉株、马尔尼菲氏青霉菌及念珠菌培养液进行检测。 结果 间接免疫荧光显示,用天然烟曲霉抗原免疫获得的单克隆抗体(mAbs-1)可广谱识别多种曲霉分离株,而重组烟曲霉抗原获得的单克降抗体(mAbs-2)仅能特异性结合临床和环境分离的烟曲霉抗原。用mAbs-1建立的双抗体夹心ELISA法可检测19种常见曲霉株培养液;用特异性针对烟曲霉抗原单克降抗体(mAbs-2)建立的双抗体夹心ELISA法可特异性检测临床和环境分离株烟曲霉培养液;与其他曲霉株无交叉反应;2种双抗体夹心ELISA法与马尔尼菲氏青霉菌及念珠菌培养液均无交叉反应。 结论 2种曲霉单克降抗体双抗体夹心ELISA法,除可广谱检测环境和临床分离曲霉株,还可以区分烟曲霉与其他曲霉,可作为监测环境、农产品、食品中的曲霉污染和早期诊断曲霉病的新技术手段。
关键词： 曲霉     单克隆抗体     双抗体夹心ELISA法     环境监测    
Study of double monoclonal antibody sandwich ELISA in detection of Aspergillus specific antigen
WANG Yan-fang, LIANG Wei-hua, HAO Wei, et al     
Institute of Basic Clinical Medicine, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, China
Abstract: Objective To establish immunological methods specific for detecting antigens in different groups of monoclonal antibodies. Methods Indirect immnofluorescence assay was applied to identify specificity of the two groups of monoclonal antibodies prepared with crude antigen and recombinant antigen of Aspergillus fumigatus,respectively.Two different double monoclonal antibody sandwich EL ISA assays established with the two groups of antibodies were performed to detect antigents in the cell culture supermatants of 19 common species of Aspergillus,Penicillium marneffei,and 5 species of Candidas. Results The results of indirect immnofluorescence assay indicated that the monoclonal antibodies prepared with crude antigen of Aspergillus fumigatus were specific for antigens in both clinical isolates and environmental isolates of Aspergillus,whereas the other group of monoclonal antibodies was proved to be specific for Aspergillus fumigatus of both clinical and environmental isolates.The ELISA assay established with the crude antigen-specfic monoclonal antibodies could detect both of the clinical and environmental isolates of Aspergllius,while the other assay could only detect Aspergillus fumigatus of both clinical and environmental isolates.And no cross reaction with the cell culture of Penialllium marneffei and Candidas was observed with the two methods. Conclusion The EL ISA assays can detect both of the clinical and environmental isolates of Aspergillus,and differentiate Aspergillus fumigatus from other species of Aspergillus.The study provides us with new tools for monitoring the contaminmetion of Aspergillus in the environment,agricultural commodities and food,and this is also useful for early diagnosis of patients with aspergillosis.
Key words: Aspergillus     monoclonal antibody     double monoclonal antibody sandwich EL ISA     environment monitoring    

曲霉是自然界中最常见的腐生菌，有100多种，其中至少10种曲霉是条件致病菌，广泛存在于家居环境、食品和农产品中。有调查发现，在北美和欧洲有23%～98%的家庭存在肉眼可见的真菌菌落[1]。环境中大量的曲霉除能诱发过敏性疾病外，还经常引起农产品、食品霉变，导致人畜真菌毒素急性中毒甚至死亡，慢性中毒诱发癌变。另外，曲霉还常引起致死性的感染，其中在免疫抑制人群中引发的侵袭性曲霉感染，死亡率高达95%，其中烟曲霉感染占80%[2]。为探索一种能够特异、快速、准确检出曲霉菌尤其是烟曲霉的方法，本研究利用2组不同的烟曲霉单克隆抗体(mAbs)，成功建立可特异性检测曲霉属抗原和烟曲霉抗原的双抗体夹心ELISA法。报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂及仪器

RPMI-1640、庆大霉索、Tween 20(美国Gibco-BRL公司)；沙氏培养基(广州市迪景微生物科技公司)；察氏培养基(广东环凯微生物科技公司)；BHC-1300 Ⅱ A/B3型生物洁净安全柜，Heracus孵箱，Forma Obital Shaker摇床,ZHWY200B摇床，Model550酶标仪(美国Bio-RAD公司。

1.1.2 抗体

烟曲霉天然抗原(本研究所制备)；基因工程重组蛋白Afmpl(香港大学微生物系)。基因工程重组蛋白Afmpl是一种特异性存在于烟曲霉菌丝细胞壁中的甘露聚糖蛋白[3-5]。本实验室用以上2种抗原分别免疫小鼠，制备2组mAbs，经捕获及检测抗体的配对试验获得2组最佳配对[6]，即抗烟曲霉天然抗原的mAbs(简称mAbs-1) 配对组：9D47A1，7E11A1-HRP(工作浓度1∶1 000) ；抗烟曲霉重组蛋白的mAbs(简称mAbs-2) 配对组：7A18A4，7C1B3-HRP(工作浓度1∶1 000) 。

1.1.3 菌株

(1) 常见致病性曲霉临床分离株5种：烟曲霉(No.5096) 、黄曲霉(No.5006) 、土曲霉(No.5274) 、黑曲霉(No.5092) (香港大学微生物系)；构巢曲霉(No.02662) (北京大学真菌和真菌病研究中心)。(2) 环境分离曲霉株13种：分别为烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、棒曲霉、亮白曲霉、聚多曲霉、黄柄曲霉、焦曲霉、赭曲霉、米曲霉，分离于发霉的粮食食品及检测仪器表面等(广东省微生物研究所菌种保藏中心)。(3) 标准株黑曲霉1株：菌株号ATCC10864(广东省微生物研究所菌种保藏中心)。(4) 马尔尼菲氏青霉菌临床分离株1株及念珠菌5株，包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌(北京大学真菌和真菌病研究中心)；相应培养液(本实验室制备)。

1.2 方法 1.2.1 培养液制备

(1) 临床分离曲霉株培养液制备：取纯水保种的临床分离曲霉株菌种10μl，沙氏平板上划单菌落，37℃活化7d后，用少许含0.05% Tween 20的生理盐水收获分生孢子悬液，迅速加至20ml RPMI-1640中，37℃ 120r/min培养3d。培养液先后经2层灭菌滤纸和0.22μm滤器过滤、分装，-30℃保存。菌丝体保留备用。(2) 环境分离曲霉株培养液制备：将斜面保种的环境分离曲霉株接种于察氏平板，28℃孵育7d，长出特征性单菌落，并制备分生孢子悬液，28℃ 120r/min。摇菌5～6d，同上方法制备过滤液。

1.2.2 间接免疫荧光法鉴定抗体的特异性

用pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)清洗上述方法中培养的14种环境分离和5种临床分离曲霉株菌丝体3次，重悬，并制备曲霉菌丝体涂片。用pH 7.4的PBS收获察氏平板上30℃培养7d的曲霉分生孢子，制备曲霉分生孢子涂片，间接免疫荧光法检测mAbs-1，mAbs-2对多种曲霉的特异性。以临床烟曲霉菌丝体及分生孢子涂片作为阳性对照，抗A型流感病毒H5的mAb以及一抗稀释液作为阴性对照。

1.2.3 双抗体夹心ELISA法检测曲霉培养液

用本实验室已建立的双抗体夹心ELISA法检测[7]。用0.1%Tween20-PBS将过滤液依次稀释为1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000。取包括原液在内的6个不同稀释度的曲霉过滤液100μl/孔，分别加至9D47A1或7A18A4包被板条中，每浓度2复孔，37℃孵育1h，洗涤后，分别相应加入1∶1000工作浓度的7E11A1-HRP、7C1B3-HRP，37℃反应30min，四甲基联苯胺(TMB)底物室温避光显色10min，酶标仪读取吸光度(A)A450。

2 结果 2.1 抗体特异性鉴定(图 1，图 2)

鉴定结果可见，mAbs-1可结合除杂色曲霉分生孢子头外多种曲霉株(包括环境分离的烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、棒曲霉、亮白曲霉、聚多曲霉、黄柄曲霉、焦曲霉、赭曲霉、米曲霉，及其相应临床曲霉株)的菌丝，间接免疫荧光结果显示呈绿色；而mAbs-2仅与环境和临床分离的烟曲霉抗原结合，间接免疫荧光结果显示呈绿色，不识别其他曲霉抗原，间接免疫荧光结果显示呈红色。2组mAbs与马尔尼菲氏青霉菌及5株念珠菌(白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌)均不结合。

图 1 mAbs-1对多种曲霉菌丝的特异性鉴定(间接免疫荧光试验，40×)

图 2 mAbs-2对多种曲霉的特异性鉴定(间接免疫荧光试验，40×)

2.2 曲霉属抗原和烟曲霉特异性抗原的检测

利用mAbs-1建立的方法可广谱结合环境分离的13株曲霉(烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、棒曲霉、亮白曲霉、聚多曲霉、黄柄曲霉、焦曲霉、赭曲霉、米曲霉)、标准株黑曲霉及临床分离的5种曲霉(烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、构巢曲霉、黑曲霉)，可以检测到的培养液稀释倍数为1∶1000～1∶10000之间；而利用mAbs-2建立的方法仅特异性的识别临床和环境分离的烟曲霉，可检测到的培养液稀释倍数为1∶1000，且与其他曲霉抗原无交叉。2组抗体建立的检测方法与马尔尼菲氏青霉菌及5株念珠菌(白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌)培养液均无交叉反应。临床和环境分离曲霉株与2组抗体结合的差异无统计学意义。

3 讨论

检测粮油食品中曲霉污染方法主要用化学分析法和竞争ELSIA法检测曲霉毒素[8]，目前缺乏快速、特异、广谱检测各种有害曲霉的方法。本研究使用由烟曲霉天然抗原和重组蛋白分别作为免疫原免疫小鼠获得广谱针对曲霉抗原mAbs-1和特异性针对烟曲霉抗原的2组单克隆抗体mAbs-2，间接免疫荧光检测结果显示：mAbs-1广谱识别所有临床和环境分离的曲霉株，而mAbs-2仅特异性结合临床和环境分离的烟曲霉抗原，2组mAbs与其他姜菌均无交叉、提示mAbs-1识别的烟曲霉天然抗原特异性存在于所有曲霉中，是曲霉属特异性抗原，面用烟曲霉重组蛋白获得的mAbs则特异性识别烟曲霉抗原，说明该组mAbs识别表位仅存在烟曲霉抗原中，与Woo等[3-5]报道一致。本研究用这2组抗体分别建立的双抗体夹心ELISA法对19种曲霉培养液检测，结果与间接免疫荧光一致。19种曲霉中5株分离于霉变粮食、食品，8株分离于环境物体表面，5株分离于临床曲霉病人，1株为标准株黑曲霉，提示这2种检测方法可分别用于环境、农作物、食品和曲霉病人标本中曲霉属和特异性烟曲霉抗原的检测。与现有的粮食食品的曲霉毒素检测的方法比较，具有广谱、特异性初筛粮食食品中多种曲霉污染的优点，从而可对受污染的样本及时处理，解决了检测时缺乏曲霉特异性或者检测谱太窄的问题。2种检测方法为曲霉病早期诊断和环境曲霉污染的监测提供了新的技术手段，具有广泛的应用前景。

参考文献
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