中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (4): 467-468   PDF    
引用本文
崔霞, 邹明强, 胡秀丽, 韩博, 金涌. 氢醌对体外培养鼠角质形成细胞毒性作用[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(4): 467-468.
CUI Xia, ZOU Ming-qiang, HU Xiu-li, et al. Toxic effects of hydroquinone on rat epidermal keratinocytes[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(4): 467-468.
氢醌对体外培养鼠角质形成细胞毒性作用
崔霞1,2, 邹明强2, 胡秀丽2, 韩博2, 金涌2     
1. 中国农业大学动物医学院 北京 100094;
2. 中国检验检疫科学研究院
收稿日期: 2007-09-29
基金项目: 国家“十一五”科技支撑计划课题(2006BAK10B09)
作者简介: 崔霞(1982- ),女,河北人,硕士在读,主要从事细胞生物学研究。
通讯作者: 邹明强
摘要： 目的 研究氢醌(Hydroquinone,HQ)对体外培养正常鼠表皮角质形成细胞的毒性作用。 方法 用0,1,2.5,5,10和25μg/ml的氢醌处理鼠角质形成细胞,检测氢醌对角质形成细胞的增殖抑制率、乳酸脱氢酶(LDH)释放率、细胞中活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量,并对超氧化物歧化酶(SOD)和还原性谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)的活力进行测定。 结果 氢醌可引起角质形成细胞活力剂量-时间依赖性降低;角质形成细胞用0,1,2.5,5,10和25μg/ml氢醌处理4,8,12,24 h后,LDH释放率呈明显的时间-剂量-反应关系;同样剂量的氢醌处理角质形成细胞,12 h后可引起ROS、MDA含量呈浓度依赖性增加(最低浓度为5μg/ml),而SOD及GSH-Px活力呈浓度依赖性抑制(最低浓度为2.5μg/ml),与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)。 结论 在体外培养条件下,氢醌可通过脂质过氧化和氧化应激对鼠角质形成细胞产生明显的毒性作用。
关键词： 氢醌     角质形成细胞     氧化应激     细胞毒作用    
Toxic effects of hydroquinone on rat epidermal keratinocytes
CUI Xia, ZOU Ming-qiang, HU Xiu-li, et al     
College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100094, China
Abstract: Objective To study the cytotoxicity of hydroquinone(HQ)on normal ratepidermal keratinocytes in vitro. Methods Keratinocytes were treated with HQ of 0,1,215,5,10 and 25μg/ml.The cell proliferation,lactate dehydrogenase (LDH)release,reactive oxygen species(ROS)level,malondialdehyde(MDA)content and activity of glutathione peroxide (GSH-Px)and superoxide dismutase(SOD)in keratinocyte were detected respectively. Results HQ could induce a dose and time-dependent decrease in cell viability.A time and concentration-dependent release of LDH was observed after cells were exposed to 0,1,215,5,10 and 25μg/ml HQ.When the same concentration HQ treated keratinocytes for 12 h,HQ also induced an increase of ROS intensity and MDA content,while an inhibition of SOD and GSH-Px activity in a concentration dependent manner.The lowest concentration were 5μg/ml and 215μg/ml,respectively.Compared withthe control group,the variance was significant(P＜0.05,P＜0.01). Conclusion The results suggest thathQ could induce cytotoxicity to cultured rat epidermal keratinocyte in vitro,which was associated withlipid peroxidation and oxidative stress.
Key words: hydroquinone     ratepidermal keratinocytes     oxidative stress     cytotoxicity    

氢醌(HQ)又名对二苯酚，是一种用途广泛的化学物质，长期接触可引起肝、肾及造血系统的损害[1, 2]。也有报道，长期皮肤暴露可引起多种皮肤损害，甚至引起氢醌职业性药疹样皮炎，出现严重的表皮松懈坏死[3, 4]。虽然有关氢醌引起皮肤损伤的报道较多，但是有关氢醌对皮肤细胞毒性作用的机制尚不清楚，这严重制约了氢醌职业性皮肤损伤的防治。为此我们建立了体外试验模型，体外培养SD大鼠表皮角质形成细胞，研究不同浓度氢醌对其细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)释放率及脂质过氧化的影响，以探讨氢醌对体外培养鼠角质形成细胞的毒性作用。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

无血清角质形成细胞培养基(K-SFM)(美国Gibco公司)；氢醌(HQ)、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)及2′，7′-二氯乙酰乙酸盐荧光素(DCHF-DA)(美国Sigma公司)；丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；CO2培养箱、酶标仪、紫外分光光度计、流式细胞仪等。

1.2 角质形成细胞的培养

参照文献[5]方法，取出生24 h以内SD大鼠的表皮，用0.25%中性蛋白酶-Ⅱ中和0.25%胰蛋白酶两步冷温消化法获取细胞，用K-SFM于6% CO2、37℃条件下培养，36 h后首次换液，以后每2～3 d换1次液，当细胞长至70%～80%时传代。

1.3 细胞毒性检测

常规消化80%融合的单层培养细胞，按每孔5×104个细胞接种于96孔培养板。培养22 h后，向96孔板中分别加入设定浓度的氢醌，以不加药物的培养物为试验对照组。分别检测12，24和48 h的细胞存活力；终止作用前各孔加20 μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h，弃上清，加150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶解，10 min后在酶标仪上于490 nm处检测，计算氢醌对角质形成细胞的抑制率。抑制率=1-试验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.4 LDH释放测定

通过LDH释放试验，检测氢醌对角质形成细胞膜损伤导致的细胞毒性：角质形成细胞以5×104个/孔的密度接种于96孔培养板，待80%细胞融合后用含0，1，2.5，5，10，25 μg/ml的氢醌进行染毒，分别在4，8，12，24 h后收集细胞，按照试剂盒提供的说明书进行测定。细胞毒性用LDH释放率表示：LDH释放率(%)=[LDH上清/(LDH上清+LDH细胞)]×100%。

1.5 细胞内活性氧(ROS)水平的测定

角质形成细胞以5×104个/孔的密度接种于96孔培养板，待80%细胞融合后用含0，1，2.5，5，10，25 μg/ml的氢醌进行染毒，分别在4，8，12，24 h后收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，孵育于含20 μmol/LDCHF-DA的无血清培养基中，30 mim后，用流式细胞仪(激发光488 nm，发射光530 nm)，测定荧光强度，计数1×105个细胞。

1.6 细胞中MDA含量、GSH-Px和SOD活力测定

不同浓度氢醌处理角质形成细胞，12 h后收集、裂解细胞，蛋白质浓度(BCA)法测定蛋白浓度；分别用硫代巴妥酸法(TBA)、二硫代二硝基苯甲酸比色法和黄嘌呤氧化酶法测定MDA含量、GSH-Px和SOD活力[6]，按试剂盒说明书操作。所有试验均做4组重复。

1.7 统计分析

用OriginPro 7.5软件录入数据并绘图，采用SPSS 3.0软件进行统计学分析。

2 结果 2.1 氢醌对角质形成细胞的毒性检测结果(表 1)

由表 1可见，氢醌对体外培养的表皮角质形成细胞有显著的抑制作用，并且随着药物浓度的加大，作用时间延长，氢醌对角质形成细胞增殖的抑制作用也显著增强。

表 1 氢醌对角质形成细胞增殖的抑制的作用(x ± s, n=4)

2.2 氢醌对角质形成细胞LDH释放率的影响(表 2)

表 2显示，角质形成细胞经氢醌作用后，LDH的释放率呈明显的时间-剂量-反应关系。各浓度组与对照组比较，LDH释放率明显增加的最低浓度为2.5 μg/ml(染毒12 h后，P＜0.05) ，最早时间为染毒后4 h(浓度为25 μg/ml时，P＜0.05) 。

表 2 氢醌染毒后角质形成细胞不同时间LDH释放率(x ± s, n=4)

2.3 氢醌对角质形成细胞活性氧水平的影响

不同浓度氢醌处理细胞不超过8 h,1 μg/ml与2.5 μg/ml浓度组与对照组相比较角质形成细胞的活性氧水平升高趋势不显著，差异均无统计学意义(P＞0.05) ；5 μg/ml浓度组角质形成细胞的活性氧水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05) ；氢醌浓度高于10 μg/ml，作用时间超过12 h，细胞内活性氧水平与对照组比较均显著的升高趋势，且差异有统计学意义(P＜0.01) 。由此可见，氢醌对角质形成细胞活性氧水平的影响同样存在浓度-时间-效应关系。

2.4 氢醌对角质形成细胞MDA含量、SOD及GSH-Px活力的影响(表 3)

表 3结果显示，不同浓度氢醌处理角质形成细胞12 h后，可引起MDA含量呈浓度依赖性增加；SOD与GSH-Px活力则相反，呈浓度依赖性抑制。各浓度组与对照组比较，使MDA含量显著性增加的最低浓度为5 μg/ml(P＜0.05) ，使SOD与GSH-Px活力显著性降低的最低浓度为2.5 μg/ml(P＜0.05) 。

表 3 氢醌染毒12h对角质形成细胞MDA含量、SOD及GSH-Px活力影响(x ± s, n=4)

3 讨论

本试验发现，氢醌可通过引起细胞膜结构的改变而影响其完整性，从而导致细胞活力下降。MTT试验表明，氢醌对体外培养的角质形成细胞增殖有显著的抑制作用，在一定条件下呈明显的剂量-时间-效应关系；细胞LDH的释放与细胞活力明显相关，可作为细胞膜损伤的有效提标。不同浓度氢醌处理角质形成细胞4，8，12，24 h后，LDH释放率显示明显的时-效、量-效关系，说明氢醌可引起细胞膜的损伤。试验发现，角质形成细胞ROS水平随氢醌浓度的升高，作用时间的延长而上升，存在时效与量效关系；同时，SOD与GSH-Px活力抑制剂量关系与MDA增加相一致，说明细胞内可能形成了较高的自由基并发生了脂质过氧化。试验结果显示，使SOD与GSH-Px活力产生明显抑制的氢醌浓度较使MDA含量显著上升的浓度低，由此推断SOD与GSH-Px活力抑制可能是氢醌对角质形成细胞毒性作用的前提，氢醌可能是通过改变细胞内的氧化应激导致MDA含量增加，导致细胞膜损伤，进而产生细胞毒性。

研究结果显示，氢醌可以引起体外培养角质形成细胞活力降低，诱发细胞膜脂质过氧化和氧化应激增加，导致细胞膜受损，产生细胞毒性作用，这不仅提供了氢醌皮肤毒性作用的基础资料，而且为氢醌引起的皮肤损伤防治提供了科学依据。

参考文献
[1] Kooyers TJ, Westerhof W. Toxicology and health risks of hydroquinone in skin lightening formulations[J]. JEADV, 2006, 20 : 777–780.
[2] Kooyers T, Westerhof W. Toxicological aspects and health risks associated with hydroquinone in skin bleaching formula[J]. Ned Tijdschr Geneeskd, 2004, 148 : 768–771.
[3] Nordlund JJ, Grimes PE, Ortonne JP. The safety of hydroquinone[J]. JEADV, 2006, 20 : 781–787.
[4] Ouyang AL, Zhou Y, Hua P, et al. Effects of trypsin on the rat keratinocyte separation and subculture[J]. Chinese J Biotechnol, 2002, 18(1) : 59–62.
[5] Hkkinen L, Koivisto L, Larjava H. An improved method for culture of epidermal keratinocytes from newborn mouse skin[J]. Methods in Cell Science, 2002, 23 : 189–196.
[6] 钟振伟, 胡利人. 低铅染毒对大鼠脂质过氧化作用的影响[J]. 中国公共卫生, 2003, 19(8) : 1000–1001.