中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (4): 448-450   PDF    
引用本文
吴小南, 陈洁, 王春兰, 郑亮. 鱼露致胃粘膜上皮细胞DNA损伤作用[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(4): 448-450.
WU Xiao-nan, CHEN Jie, WANG Chun-lan, et al. Effects of DNA damage of fish sauce on gastric epithelial cell[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(4): 448-450.
鱼露致胃粘膜上皮细胞DNA损伤作用
吴小南, 陈洁, 王春兰, 郑亮     
福建医科大学公共卫生学院营养与保健医学系 福州 350004
收稿日期: 2007-08-06
基金项目: 福建省教育厅科研基金(JA05253);福建省科技厅平台建设项目基金(2006F1002)
作者简介: 吴小南(1963- ),男,福建南安人,教授,博士,主要从事营养与保健资源开发研究。
摘要： 目的 研究鱼露及亚硝化鱼露致胃粘膜上皮细胞DNA的损伤作用。 方法 应用改良的单细胞凝胶电泳技术,进行体外和体内试验,观察胃粘膜上皮细胞DNA损伤程度。 结果 体外试验测定尾长、尾矩和OLIVE尾矩发现亚硝化鱼露高剂量组((13.42±3.74),(1.12±0.67),(1.21±0.71)μm)、中剂量组((12.68±4.44),(1.07±0.68),(1.12±0.69)μm)及低剂量组((11.79±4.49),(0.98±0.72),(1.05±0.70)μm)均高于阴性对照组((9.14±2.54),(0.62±0.60),(0.60+0.59)μm),两两比较差异均有统计学意义(χ尾长2=296.10;F尾距=27.62;χOLIVE尾矩2=436.62;P＜0.01)。体内试验中尾长、尾矩和OLIVE尾矩50%亚硝化鱼露组((14.51±4.54),(2.76±2.26),(3.03±2.32)μm)、25%亚硝化鱼露组((13.49±4.42),(2.06±1.86),(2.25±1.98)μm)均高于阴性对照组(11.82±3.80),(1.12±0.80),(1.35±1.19)μm),两两比较差异有统计学意义(χ尾长2=88.1l;χ尾距2=165.83;χOLIVE尾矩2=198.11;P＜0.01)。体外试验还发现,亚硝化鱼露浓度越高致DNA损伤作用越强,存在剂量一反应关系(r尾长=0.999,P＜0.05;rOLIVE尾矩=0.997,P＜0.05)。 结论 鱼露经亚硝化后对胃粘膜上皮细胞DNA有损伤作用。
关键词： 鱼露     胃粘膜上皮细胞     DNA损伤     单细胞凝胶电泳    
Effects of DNA damage of fish sauce on gastric epithelial cell
WU Xiao-nan, CHEN Jie, WANG Chun-lan, et al     
Department of Medical Nutrition and Health, School of Public Health, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China
Abstract: Objective To explore damage effect of fish sauce and nitrosated fish sauce on DNA in gastric epithelial cell. Methods The DNA damage effect of fish sauceong astric epithelial cell was observed in vitro and in vivo by improved single cell gel electrophoresis assay. Results The tail length,tail moment and OLIVE tailmomentin for nitr osated fish sauce groups of high dose[(13.42±3.74),(1.12±0.67),(1.21±0.71)μm],middle dose[(12.68±4.44),(1.07±0.68),(1.12±0.69)μm]and low dose[(11.79±4.49),(0.98±0.72),(1.05±0.70)μm]were significantly higher than those in control group[(9.14±2.54),(0.62±0.60),(0.60±0.59)μm]in vitro.There were statistical differences between any two groups(χtailength2=296.10;Ftailmoment=27 62;(χOLIVE tailmoment2 =436.62;P＜0.01).And in vivo the taillength,tailmoment and OLIVE tailmoment in the groups of 50% nitrosated fish sauce[(14.51±4.54)(2.76±2.26)(3.03±2.32)μm] and 25%nitrosated fish sauce[(13.49±4.42)(2.06±1.86)(2.25±1.98)μm]were hig her than those in control group [(11.82±3.80)(1 12±0.80)(1.35±1.19)μm].There were also statistical differences between any two groups(χtailength2=88.11;χtailmoment=165.83;χtailmoment=198.11;P＜0.01).And in vitro the higher the concentration of nitrosated fish sauce was,the stronger the damage effect of DNA was.There was dose-response relationship(rtailength=0.999,P＜0.05,rOLIVE tailmoment=0.997,P＜0.05). Conclusion Fish sauce exists damage effect on DNA in gastric epithelial cell through ni trosation.
Key words: fish sauce     gastric epithelial cell     DNA damage     single cell gel electr ophoresis    

鱼露是福建省胃癌高发的长乐市居民喜食的调味品，流行病学资料表明[1]，食用鱼露是该地区胃癌高发的一个重要危险因素，鱼露含有大量N-亚硝基化合物的重要前体物质胺类(包括二级胺、酰胺、氨基酸)，可与胃酸中的亚硝酸盐合成强致癌、致突变物质-N-亚硝基化合物。目前长乐地区流动摊贩的散装鱼露通常未经卫生检验合格即出售，胺类物质甚至N-亚硝基化合物的含量可能较高，故本试验利用单细胞凝胶电泳技术，评价此鱼露样品致胃粘膜上皮细胞DNA损伤的作用，为进一步揭示胃癌的病因及预防胃癌提供依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物及细胞

SPF级BABL/C小鼠36只(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，许可证号SCXK(沪)2003-0003，雌雄各半，体重(22±2) g；人胃粘膜上皮细胞系GES-1(北京肿瘤防治研究所细胞遗传室)。

1.2 主要仪器与试剂

DYY-III-6B型电泳仪(北京市六一仪器厂)；CK40倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；DMiRB型荧光倒置显微镜(德国Leica公司)；DK-8D型电热恒温震荡水槽(上海精宏实验设备有限公司)；Z-323k型台式高速冷冻离心机(德国Hermle公司)。高糖培养液(DMEM)、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；环磷酰胺(江苏恒瑞制药厂)；链霉蛋白酶Pronase和二硫苏糖醇DTT(德国Merck公司)；牛血清白蛋白(美国Biosharp公司)；过氧化氢(美国Sigma公司)；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖、十二烷基肌氨酸钠、曲拉通x-100、溴化乙锭、二甲基亚砜、乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)和三羟甲基氨基甲烷(美国Amresco公司)；其他试剂均为市售分析纯。

1.3 鱼露及亚硝化处理

鱼露的制作：鲜鱼绞碎，加入鱼重30%～40%的食盐，拌匀，每层均盐封，腌渍6～12个月，期间多次翻拌，使腌渍后的鱼肉含盐在24%～26%；常温下利用鱼自身的酶和微生物自然发酵数月，或控制温度50～60℃，加入蛋白酶人工发酵15～30 d；并经过滤、浸提、混合、调配、装瓶等工艺完成[2]。本试验采集胃癌高发区福建长乐各乡不同流动摊贩的散装鱼露10份，混匀。每10 ml鱼露与40 mg亚硝酸钠混合摇匀，调pH 2～3，37℃温箱孵育3h后即成亚硝化鱼露，置冰箱备用。

1.4 实验方法 1.4.1 试剂配置

缓冲液A(MA)溶液(mmol：0.5NaH2PO4，1.0Na2HPO4，20NaHCO3，80NaCl，5.0KCl，50HEPES，11葡萄糖，2%牛血清白蛋白，2EDTA·2Na，pH7.4) ；缓冲液B(MB)溶液(mmol：0.5NaH2PO4，1.0Na2HPO4，20NaHCO3，80NaCl，5.0KCl，50 HEPES，11葡萄糖，1%牛血清白蛋白，1.0CaCl2，1.5MgCl2，pH7.4) ：缓冲液C(MC)溶液(mmol：0.5NaH2PO4，1.0Na2HPO4，20NaHCO3，80NaCl，5.0KCl，50HEPES，11葡萄糖，0.1%牛血清白蛋白，1.0CaCl2，1.5MgCl2，1.0DTT，pH7.4) 。MAP消化酶：Pronase溶于MA缓冲液中，浓度为1g/L，临用前配置。过滤除菌，分装备用。

1.4.2 体外试验

常规培养人胃粘膜上皮细胞(GES-1) ，经0.25%胰蛋白酶消化获得细胞悬液，1 000 r/min离心5 min后重悬，分别加入鱼露和亚硝化鱼露，使终浓度分别为1%、0.6%和0.2%(高、中、低剂量组)，阳性对照组加过氧化氢使终浓度为100 μmol/L，阴性对照组加入等体积的生理盐水。37℃水浴孵育60 min。染毒完毕后离心去除受试物，磷酸盐缓冲液(PBS)重悬制成单细胞悬液，立即进行彗星试验。

1.4.3 体内试验

将36只小鼠随机分为6组，每组6只，雌雄各半。鱼露组和亚硝化鱼露组按0.25 mL/(10g·bw)灌胃2 d，每天1次；阳性对照以0.5 mg/(10g·bw)环磷酰胺腹腔注射，阴性组腹腔注射等体积生理盐水。末次染毒24h后颈椎处死取胃，于胃底处剪一切口置冰冷生理盐水充分洗涤，然后将丝裂源原激活蛋白（MAP)消化酶注入胃袋结扎。将胃袋放入MA中，37℃水浴消化60 min，震荡80次/min。胃袋在MA中充分孵育后放入MB中，轻轻搅拌50 min，每10 min收集1次细胞，过200目筛，1 000 r/min离心5 min，MC洗2次，最后用MC悬浮，即可得到胃粘膜上皮细胞悬液[3, 4]。经台盼蓝染色，细胞存活率大于90%者立即进行彗星试验。

1.4.4 DNA损伤程度检测(彗星试验)

按传统方法[5]稍作改进，用24孔细胞培养板的板盖代替磨砂玻片铺胶，0.5%正常熔点琼脂糖100 μl铺第一层胶，0.5%低熔点琼脂糖100 μl和20 μl细胞悬液(约含400个细胞)混合，立即铺第二层胶，经4℃裂解、解旋、电泳、中和，溴化乙锭染色后尽快在荧光显微镜下观察。以上步骤均避光、低温操作，避免额外的DNA损伤。

体内试验每只小鼠制成1张片，体外试验每组2个平行管，每管铺3片；每片均随机观察30个细胞，每组共观察180个细胞。用CASP软件逐个分析细胞[6, 7]，取尾长(彗星尾部最远端与头部中心的距离)、尾矩(从彗星头的右边界到彗星尾部末端的距离与尾部DNA含量的乘积)、OLIVE尾矩(从头光密度重心到尾光密度重心的距离与尾部DNA含量的乘积)等指标比较各组DNA的损伤程度。

1.5 统计分析

应用SPSS 11.0软件对体内外实验数据进行秩和检验、方差分析、组间均数两两比较及相关回归分析。

2 结果 2.1 鱼露及亚硝化鱼露体外致DNA损伤作用

经秩和检验和方差分析，各组尾长、尾矩、OLIVE尾矩之间差异均有统计学意义(χ尾长2=296.10；F尾距=27.62；χOLIVE尾距2=436.62；P值均＜0.01) ；与阴性对照组比较，各亚硝化鱼露组差异均有统计学意义(P＜0.01) ，而鱼露组差异均无统计学意义(P＞0.05) ；同剂量的鱼露组和亚硝化鱼露组比较差异均有统计学意义(P＜0.01) ；说明鱼露经亚硝化后可致人胃粘膜上皮细胞DNA损伤，且亚硝化鱼露浓度越高致DNA损伤作用越强，存在剂量-反应关系(r尾长=0.999，P＜0.05，y尾长=2.038x+11.408；rOLIVE尾矩=0.997，P＜0.05，yOLIVE尾距=0.2x+1.007) ，见表 1。

表 1 鱼露、亚硝化鱼露体外致人胃粘膜上皮细胞DNA损伤作用(x ± s, μm)

2.2 鱼露及亚硝化鱼露体内致DNA损伤作用

经秩和检验，各组尾长、尾矩、OLIVE尾矩之间差异均有统计学意义(χ尾长2=88.11；χ尾距2=165.83；χOLIVE尾矩2=198.11，P值均＜0.01) ；与阴性对照组比较，亚硝化鱼露组差异均有统计学意义(P＜0.01) ，各鱼露组差异均无统计学意义(P＞0.05) ；同剂量的鱼露组和亚硝化鱼露组比较有统计学意义(P＜0.01) ，说明亚硝化鱼露对小鼠胃粘膜上皮细胞DNA有损伤作用，鱼露则没有明显的损伤作用，见表 2。

表 2 鱼露、亚硝化鱼露体内致小鼠胃粘膜上皮细胞DNA损伤作用(x ± s, μm)

3 讨论

本试验应用改良的单细胞凝胶电泳技术，采用24孔细胞培养板的板盖铺胶，不易脱片；镜下观察发现染色均匀，背景清晰无杂质，彗星图片质量很高。用国际公认的CASP图像分析软件[6, 7]评估细胞DNA的损伤程度，采用尾长、尾矩、Olive尾矩来进行全面评价[8],使结果更加准确和客观。

鱼露样品中的N-亚硝基化合物总含量检出范围为0.2～16μmol/L，在pH=2条件下亚硝化后其含量提高约4800倍[1]。N-亚硝基化合物是强致癌物质，可致胃粘膜上皮细胞DNA的损伤，形成大量带负电荷的DNA断片。在电泳时，断片离开主核向阳极迁移，经荧光染料染色，形状如同彗星，在一定条件下，彗星尾的长度可反映DNA损伤的大小[8]。基于此原理，本试验以体内外试验相结合的方式研究不同剂量的鱼露和亚硝化鱼露对小鼠及人胃粘膜上皮细胞DNA的损伤作用，结果表明长乐地区流动摊贩的鱼露样品经亚硝化后有致突变作用，而鱼露则没有明显致突变作用，此结论还有待于其他试验如微核试验、基因突变试验等进一步验证。

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