2008, Vol. 24
芹菜素(apigenin)属于黄酮类化合物，广泛存在于水果、蔬菜、豆类、茶叶中，其中芹菜含量最高。研究发现芹菜素具有广泛的药理学作用和生物学特性，如抑制肿瘤、预防高血压、抗氧化、抗菌、降低肿瘤细胞多耐药性、抗突变等[1]。有观点认为，芹菜素的健康促进作用主要依赖于个体摄入量和生物利用度。为了更好地了解芹菜素在体内的吸收、分布、代谢等情况，本研究通过模拟大鼠肠道内环境研究大鼠肠道菌群对芹菜素代谢的影响，为其营养学、药理学及开发研究提供依据。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂(1) 仪器：Waters2690高效液相色谱检测仪(HPLC)；超纯水器(德国SG公司)；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)GAST真空泵；水浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)。(2) 试剂：芹菜素标准品(美国Sigma公司)；甲醇色谱纯(山东禹王实业有限公司化工分公司)；磷酸优级纯(天津科密欧化学试剂有限公司)；水为重蒸水。
1.2 芹菜素标准贮备液准确称取芹菜素标准品50.0mg，置于50ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释定容至刻度，此溶液为1mg/ml的芹菜素标准贮备液，放入4℃冰箱中备用。
1.3 样品预处理 1.3.1 人工肠液的配制称取6.8gKH2P04溶解250ml水中，加入190ml 0.2mol/L的NaOH和400ml水，混匀，用0.2mol/L的NaOH调节混合液的pH值至7.5±0.1，加水定容至1000ml。
1.3.2 鼠粪收集成年SD清洁级大鼠20只，体重180～230g，哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供；收集新鲜鼠粪，准确称量60g。
1.3.3 鼠粪样品的处理将60g新鲜鼠粪溶解于180ml人工肠液中，用磁力搅拌器搅拌均匀后，用双层纱布过滤，取18.5ml滤液加入0.27ml 1mg/ml芹菜素标准溶液混匀作为样品；另取18.5ml人工肠液加入0.27ml 1mg/ml芹菜素标准溶液混匀作为样品对照；分别取样品和样品对照0.6ml分装至2ml离心管中(样品和样品对照各装30个离心管)，充入CO2，封口膜封口。
1.3.4 样品制备与分析将分装后的离心管于水浴振荡器中以37℃，80r/min孵化，孵化前留取0h样品及0h人工肠液样品对照，然后分别留取孵化后1，4，8，24h的样品和样品对照(每个时间点样品和样品对照均平行6份)。将样品和样品对照取出后放入-40℃冰箱中保存。分析前先将样品解冻，高速冷冻离心机4℃,9800g离心15min，取上清液，用氮气吹干后加0.6ml流动相溶解，取10μl进样进行HPLC测定。
1.4 色谱条件色谱柱为Phenomenex C18柱(250×4.60mm，4μm)；流动相：甲醇/0.1%磷酸(60/40,v/v)；超声波脱气；流速：1.0ml/mim；柱温为30℃；检测波长为339nm；进样量为10μl；采用等度洗脱。
2 结果 2.1 色谱图(图 1，图 2)图 1显示，芹菜素保留时间为14.040min。图 2显示，芹菜素与大鼠孵育液中的其他成分分离完全。
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图 1 芹菜素标准品色谱图 |
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图 2 样品色谱图 |
2.2 标准曲线和检测限
以芹菜素标准贮备液配制0.5，1，2，4，8，10μg/ml的标准系列，按色谱条件分别进样，对每一浓度均求其5次测量的平均值，以峰面积积分值(Y)对浓度(X)进行线性回归，得出直线回归方程Y=37975X-2645,9。r=0.9995(n=5) 。线性范围为0.5～10μg/ml。以3倍噪音浓度为最低检出限，得芹菜素的最低检出限浓度为0.11μg/ml。
2.3 精密度实验取4μg/ml的芹菜素标准溶液10μl，按色谱条件进样，连续进样10次。测得芹菜素峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.55%，表明仪器进样精密度良好。
2.4 稳定性实验取预先灭菌的肠道菌孵育液18.5ml，加入0.27ml1m/ml芹菜素标准溶液，样品预处理后按色谱条件进样，分别测定孵化0，1，4，8，24h后其中芹菜素的含量。测得芹菜素峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.86%，表明芹菜素在灭菌的大鼠肠道菌孵育液中24h内稳定。
2.5 重现性实验取大鼠肠道菌孵育液18.5ml，加入0.27ml1mg/ml芹菜素标准溶液，样品预处理后按色谱条件进样，测定孵化后4h的样品中芹菜素的含量(设6个平行样)。测得芹菜素峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.78%，表明该方法的重现性较好。
2.6 回收率实验取预先灭菌过的大鼠粪便菌孵育液0.5ml，准确加入1，5，10μg/ml浓度的芹菜素标准品溶液80μl，每个浓度平行5份。样品预处理后按色谱条件进样。芹菜素的回收率在98.1%～99.0%之间。
2.7 芹菜素体外肠道菌代谢芹菜素在离体培养的大鼠肠道菌孵育液中降解较多，在人工肠液中降解较少，而在灭菌后的大鼠肠道菌育液中几乎无降解，说明肠道菌群影响芹菜素的代谢。
3 讨论肠道菌群对物质的代谢或化学修饰作用国内外研究最多的是药物，研究多采用高效液相色谱法[2, 3]，其中整体实验研究较多，离体实验研究相对较少。有关肠道菌群对黄酮类物质的代谢目前主要集中在不同膳食类型黄酮类物质吸收代谢情况的差异[4]、同种类型不同化学结构的黄酮类物质代谢情况的差异[5]、加入催化反应的酶后黄酮类物质代谢情况的变化[6]、不同黄酮类物质代谢后代谢产物的研究[7]等。本研究发现，在离体条件下，芹菜素易被大鼠肠道菌群降解，孵化1h后芹菜素迅速被肠道菌群代谢，随着孵化时间的延长，芹菜素被大鼠肠道菌群代谢的速度放缓，至24h后孵育液中芹菜素含量最低。另外，在不同环境下，芹菜素降解有较大差异，在灭菌后的大鼠肠道菌孵育液中几乎无降解，在人工肠液中有少量降解，在大鼠肠道菌孵育液中降解较多。通过人工肠液和灭菌后的大鼠肠道菌孵育液作为对照，表明在大鼠肠道菌孵育液中芹菜素的降解主要是肠道菌群的作用。通过0h样品与1，4，8，24h样品的比较，表明未经孵化的肠道菌群对芹菜素无降解作用，而经过水浴振荡器37℃，80r/min孵化的肠道菌群可以对芹菜素进行代谢降解。
| [1] | 孙斌, 瞿伟菁, 张晓玲. 芹菜素的药理作用研究进展[J]. 中药材, 2004, 27(7) : 531–534. |
| [2] | 吕应年, 吴科峰, 梁念慈. 高效液相色谱法测定半边旗中芹菜素含量[J]. 药物鉴定, 2007, 16(5) : 16–17. |
| [3] | Liping Li, Huidi Jiang, Haohao, et al. Stimultaneous determination of luteolin and apigenin in dog plasma by RP-HPLC[J]. Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 37 : 615–620. DOI:10.1016/j.jpba.2004.11.012 |
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| [5] | L A GRIFFITHS, GESMITH. Metabolism of apigenin and related compounds in the rat[J]. Biochem, 1972, 128 : 901–911. DOI:10.1042/bj1280901 |
| [6] | Blaut M, Schoefer L, Braune A. Transformation of flavonoids by intestinal microorganisms[J]. Int J Vitam Nutr Res, 2003, 73 : 79–87. DOI:10.1024/0300-9831.73.2.79 |
| [7] | Anna-Marja Aura, Pilar Martin-Lopez, Karen Anne O'Leary, et al. In vitro metabolism of anthocyanins by human gut microflora[J]. Eur J Nutr, 2005, 44 : 133–142. DOI:10.1007/s00394-004-0502-2 |