随着水体富营养化程度的日益加重，蓝细菌毒素对人群健康的急性和潜在远期危害逐渐引起关注。蓝细菌毒素的种类和数量随着时间也不断增加，最常见的蓝细菌毒素是微囊藻毒素-LR(MC-LR)，为环状7肽结构。据2004年资料，目前己知有80多种微囊藻毒素^[1]。1998年，世界卫生组织对饮用水微囊藻毒素作出了严格限定：微囊藻毒素-LR当量＜1μg/L。因此，建立灵敏、特异的水中蓝细菌毒素检测方法是今后研究其危害的手段之一。本文对化学仪器分析法(高效液相色谱等)、生物化学法(蛋白磷酸酶抑制试验)、免疫检测法(ELISA)和生物检测法(动物/细胞学试验)等，迄今国内外常用的检测水中微囊藻毒素的方法及有关新动态进行综述。这些方法在检测原理、提供的信息、操作的难易和繁杂程度上有很大差别。现分别介绍如下。

1 化学仪器分析法

随着仪器分析的发展，藻类毒素的检测方法不断增多，如高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)、色质谱联用(LC-MS)、毛细管电泳(CE)、核磁共振(NMR)等，其中HPLC是使用最为广泛和成熟的方法。这些分析方法利用藻类毒素分子结构上的特殊功能基团如紫外发色团，分子量差异，极性或非极性等物理化学性质，而实现对藻类毒素的分离、纯化和鉴定。

1.1 高效液相色谱(HPLC)

高效液相色谱(HPLC)是目前应用最多的方法^[2-5]，其对微囊藻毒素既可定性又可定量。如果有标准品，HPLC根据保留时间可以对微囊藻毒素同系物加以鉴别，根据峰面积而定量。然而，在众多同系微囊藻毒素中，只有有限的几种商业用标准品。所以，通常用MC-LR当量表示样品中微囊藻毒素总量。

分离藻类毒素可采用多种固定相，如反相C18柱、酰胺C16柱、内部界面反相柱、离子交换柱等；但以反相C18柱应用最广泛。流动相采用含一定比例甲醇或乙腈的水相。选择合适的流动相可提高方法的分辨率，是精确测量的前提。通常HPLC系统都偶联有不同检测器，以实现对分离后单一化合物的检测。紫外检测器(UV)和光电二极管阵列检测器(PDA)最为常用。

多数微囊藻毒素和节球藻毒素(泡沫节球藻产生的一种毒素)在238nm处有最大紫外吸收峰，HPLC设备的紫外检测器(UV)波长可设在此处，记录样品提取物发出的信号。然而，样品提取物也可能含有其他化合物，在此波长有吸收作用，从而干扰最终结果。在高浓度天然有机物水体背景下，HPLC检测微囊藻毒素的下限为1μg/L；Fawetl等^[3]有所改进，使检测下限为0.5μg/L，但仅适于游离微囊藻毒素-LR，不能检测总微囊藻毒素(游离和细胞结合)。

1994年，Lawton等^[4]建立的反相HPLC方法，24h内即可进行对源水或饮用水多种微囊藻毒素和节球藻毒素的检测。该方法需要过滤水样，将蓝细菌细胞和水样分离，以达到对细胞内、外毒素含量的测定。水中微量藻类毒素用C18固相吸附柱富集，接着用高效液相色谱光电二极管检测器进行定性和定量检测。将微囊藻毒素和节球藻毒素混合物分别接种于源水和饮用水，采用反相HPLC方法检测，获得了满意的回收率，其检测下限低至0.25μg/L。

紫外检测器(UV)成本较低，缺点是如果伴随微囊藻毒素一同洗脱出其他化合物，其单波长吸收峰就会受到干扰。光电二极管阵列检测器(PDA)比单波长紫外检测器分辨率高，因为它有一个特定的光谱吸收范围，通常是190～280nm，微囊藻毒素和节球藻毒素在238nm处有最大典型吸收峰。

虽然HPLC对藻类毒素各种同系物可做到鉴别、定量，是了解藻类毒素化学性质甚至结构的重要手段，也是环境监测不可或缺的支撑技术，但是HPLC方法对大型仪器设备的依赖，对高纯度标准样品的制备，以及对具有专门操作技术人员的需要，均限制了该方法在普通实验室的普及应用。此外，HPLC方法不能对藻类毒素的生物学活性、毒性作用进行判别和鉴定。

2001年，Poon等^[5]利用固相微萃取-HPLC方法检测微囊藻毒素，相微萃取的优点是非溶剂提取受检物，也无需清洗步骤，程序相对简化。该方法检测灵敏度为500μg/L。

1.2 色质谱联用(LC-MS)

如果要进一步证实和鉴定藻类毒素，就需要色质谱联用(LC-MS)这类更为先进和精密的仪器方法。质谱仪对多肽类藻毒素有最佳分辨效果，因为这些毒素可产生典型的离子谱。LC-MS方法由于其优良的选择性，对样品的纯化步骤要求不高，能够在混合物中同时实现多种藻类毒素的分离和鉴定。其对微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素-YR、微囊藻毒素-RR的检测下限分别为37，42和23ng/L^[6]。质谱检测器可测定分子量和洗脱化合物的重要分子片段，因此，检测结果特异性非常好。过去用PDA不能分辨的不同多肽类藻毒素，质谱检测器均可加以区分。

1.3 毛细管电泳(CE)

该法具有柱上富集功能，分析速度快，检测样品量多，易于实现自动化等功能。但是，同HPLC检测法比较其灵敏度不够，检测下限为1mg/L^[7]。有报道将微囊藻毒素-LR衍生为荧光化合物，应用激光诱导荧光(1aser-induced fluorescence，LIF)检测器可提高灵敏度^[8]，但是还需更多验证与改进。目前CE法尚不是常规水体检测藻类毒素的手段。

1.4 其他

也有关于将微囊藻毒素氧化，把其Adda侧链断开形成3-methoxy-2-methy1-4 phenylbutyric acid(MMPB)，将MMPB转化成荧光衍生物，通过气相色谱(GC)气质联用(GC/MS)或HPLC等方法测定MMPB^[9]。它需要提取、纯化、氧化及后处理等繁琐步骤。二维核磁共振(2DNMR)方法^[10-11]被用来阐明藻类毒素异构体的化学结构，通常样品需要量大(mg)，而且样品要求纯度高，仪器设备也很昂贵。

2 生物化学法 2.1 蛋白磷酸酶抑制试验

蛋白磷酸酶抑制试验是依据微囊藻毒素对蛋白磷酸酶1(PP1) 和蛋白磷酸酶2A(PP2A)具有高效和不可逆的抑制作用而建立的酶学活性检测方法。丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶负责细胞内蛋白磷酸化后的脱磷酸过程，根据对不同分子的标记方式和不同类型的底物转变，大致有3种信号采集方法：产色反应、放射性检测、荧光反应。蛋白磷酸酶抑制试验可定量测定水样中微囊藻毒素-LR，检测灵敏度可达0.5～1.57μg/L。该方法优点是快速，数小时即可实现对大量样品的检测。然而，该方法特异性稍差，其他对蛋白磷酸酶具有抑制作用的物质可能会干扰试验，但这不是主要问题，因为对已知有可能存在产毒藻种和毒素的特定环境，该方法是有效的。与HPLC比较，蛋白磷酸酶抑制试验是一种功能性测定方法，但不能对藻类毒素的同系物进行鉴别。该方法的一个主要缺陷是特异性蛋白磷酸酶等没有商品供应，需各实验室自己制备。

2000年，Sewes等^[12]报道一种竞争性结合蛋白磷酸酶2A(PP2A)的超敏方法检测藻类毒素，他们用125I标记的已知微囊藻毒素-LR与待检样品、PP2A混合，竞争性结合PP2A的催化亚单位，然后用Sephadex G-50过柱，清除未结合的游离藻毒素，检测结合型藻毒素的放射性强度。微囊藻毒素-LR最低检测限为0.05μg/L。

Fontal等^[13]采用一种新的PP1、PP2A的荧光底物6,8-二氟-4-甲基伞酰磷酸酯(DiFMUP)，在蛋白磷酸酶作用下，DiFMUP的水解产物DiFMU产生高强度的荧光，通过荧光强度的高低，可推算微囊藻毒素对PP1、PP2A的抑制程度，进一步换算成毒素的浓度。该方法可在多孔微量板上完成，检测范围0.08～800pg/孔。

3 免疫检测法 3.1 酶联免疫吸附实验(ELISA)

20世纪80年代末Kifir、Brooks等分别报道了对藻类毒素的单克隆抗体和多克隆抗体的研制工作，但其检测方法灵敏度不够，尚不能用于环境样品检测。

3.1.1 多克隆抗体

1989年，Chu等^[14]开发了可以满足微囊藻毒素-LR(MC-LR)检测的高灵敏度兔多克隆抗体。该抗体与MC-LR的其他同系物如微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-YR及节球藻毒素有良好的交叉反应；但与微囊藻毒素-LY、微囊藻毒素-LA交叉反应比较弱；不与臭氧分解的MC-LR发生反应。1990年，Chu等^[15]首先应用直接竞争ELISA方法检测富营养化水中微囊藻毒素，检测下限为0.2μg/L。直接竞争ELISA方法其原理是将抗藻毒素抗体包被在多孔板上，被检样品、MC-LR标准品与标记有过氧化物酶的MC-LR竞争性结合多孔板上的抗体，过氧化物酶催化底物产生的颜色与MC-LR的浓度成反比，即深色表明MC-LR浓度低，浅色表示MC-LR浓度高。也有将MC-LR牛血清白蛋白包被在多孔板上，利用第一抗体和带标记的抗体而建立的间接竞争ELISA方法。间接竞争ELISA比直接竞争ELISA方法灵敏度略高。

3.1.2 单克隆抗体

1996年，Ueno等^{[16, 17]}用单克隆抗体检测水中微囊藻毒素，检测下限为0.05μg/L，他们对日本、泰国、德国和葡萄牙的湖水、水库等环境水体进行了检测，表明ELISA方法是大规模筛选检测藻类毒素污染的可靠方法。随后国内也有引进该技术开展调查研究的相关报道^[18-20]。

3.1.3 噬菌体库展示抗体

2002年，McElhiney等^[21]利用噬菌体库展示技术筛选分离抗微囊藻毒素-LR的重组抗体片段。其中所获最灵敏的单链抗体(scAb)检测下限是0.8μg/L，且与HPLC具有良好的相关性。将scAb制备成免疫层析柱，可浓缩水中的微囊藻毒素-LR，供下一步HPLC分析。这是第三代抗体制备技术在藻类毒素检测中的应用。不用动物材料，即可经济、快速、大量的制备针对藻类毒素的抗体，为开发各种新颖的检测技术提供了丰富的想象。

3.1.4 ELISA商业试剂盒

现在已经有检测微囊藻毒素ELISA商业试剂盒^{[22, 23]}，既可在试管也可在多孔板中进行实验，通常需要配备可见分光光度计或酶标仪。试剂盒提供0.1，0.4，1.6μg/L的标准物可作标准曲线。多克隆抗体可与多种微囊藻毒素同系物反应，但并非所有的同系物。而针对某一种微囊藻毒素的单克隆抗体也有可能和其他微囊藻毒素发生交叉反应。ELISA方法通常比较快捷，1.5h即可完成实验。为了避免假阳性和提高检测灵敏度，建议对水样预先用C18柱富集洗脱，再行ELISA检测。目前国内有多家实验室正在开发研制该项技术，但尚未商品化生产，主要依赖进口产品，检测每份样品约需50～120元左右。

3.2 免疫层析方法

2003年Kim等^[24]开发了快速一步法免疫层析荧光定量检测微囊藻毒素方法。将单克隆抗体标记荧光素(Alexa Fluor 647) ，然后将抗体包埋固定在硝酸纤维素膜条带上，将条带装入一次性使用的套板内，利用与套板匹配的荧光扫描仪定量采集条带上的荧光强度。通过建立固定抗体系列标准曲线，微囊藻毒素-LR浓度范围在125～2000pg/ml,具有良好的线性关系，检测下限为95.38pg/ml。若将抗原包埋固定可进一步提高检测灵敏度，检测下限可达47.23pg/ml。通过对地面水的应用，其灵敏度仅受水中其他物质的轻微干扰。该方法15min即可获得结果，适合现场实时定量监测目的。

2006年Pyo等^{[25, 26]}用胶体金免疫层析条快速检测微囊藻毒素-LR，灵敏度1ng/ml，15min即可出结果，费用为ELISA方法的1/10。肉眼可区分不同梯度的毒素浓度，但精度不高，不能进行定量分析。

4 生物检测法 4.1 动物实验

微囊藻毒素可导致多种动物中毒死亡，实验室多用小鼠或大鼠作动物模型^{[27, 28]}，通常采用腹腔注射途径给毒，小鼠LD₅₀比大鼠LD₅₀要低一些。小鼠实验是一种非常重要的藻类毒素筛选工具，它能够在数小时完整显现样品的毒性作用，还可区分不同靶器官作用终点，即肝脏毒素还是神经毒素，这是化学分析方法做不到的。缺点是动物实验检测灵敏度不够，特别是对出厂水，而且不能特异识别毒素的种类。例如，有些蓝细菌既可产生微囊藻毒素，又可产生鱼腥藻毒素，如果用小鼠实验可能忽略或掩盖微囊藻毒素的作用。因为鱼腥藻毒素可在数分钟内使小鼠致死，而微囊藻毒素约需数十分钟使小鼠致死。Bhattacharya等^[29]用鼠肝切片培养技术快速筛选各种蓝细菌产生的毒素。经微囊藻毒素-LR处理后，肝细胞肿胀，胞浆出现颗粒，有嗜伊红细胞碎片淤积和充血迹象。该方法灵敏度为μg/L级。

4.2 细胞学实验

利用原代肝细胞培养也可快速检测藻类毒素，国内学者^{[30, 31]}用2步灌流法制备大鼠原代肝细胞，经微囊藻毒素-LR处理后，数小时后细胞形态学即发生改变，其灵敏度可达μg/L级。多数传代细胞对微囊藻毒素不敏感，人口腔表皮癌KB细胞与其他传代细胞比较相对敏感，但与原代肝细胞相差达3～4个数量级(mg/L)。利用原代肝细胞检测微囊藻毒素，可减少动物的使用量，而受试细胞的同质性还可避免动物实验的个体差异。缺点是该方法需要掌握一定细胞培养技术的人员操作。

5 其他

国内学者^[32]利用指数富集配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术，尝试在体外从大容量寡核苷酸库，筛选能够紧密而特异地与藻类毒素靶分子结合的核酸配基(aptamer)。核酸配基具有高度复杂和精确的分子识别性质，它类似于抗体，但不需在体内制备，而且制备过程经济、快速。但是目前还未找到高亲合力的aptamer，因此，将其用于藻类毒素的检测，尚不能满足世界卫生组织制订的标准。

6 小结

综上所述，蛋白磷酸酶抑制试验、ELISA、生物检测法不需要复杂的分离纯化过程即可指示水样中是否有毒素存在，快速、经济、重现性好，适用于初筛检测；而若对藻类毒素种类和成分进行分离、鉴定和定量分析，则需依赖HPLC等先进的大型分析仪器，但存在繁琐的分离提纯过程和制备、获取标准品的局限。根据不同研究目的和需要，实验设备条件和专业化程度，可结合二者开展工作。由于发现藻类毒素的种类和数量在不断增加，如何分离纯化、鉴定这些微量污染物，阐明它们的结构、功能和生物活性，建立灵敏、特异、经济、快速监测环境中混合和单一毒素的方法，都是未来研究的方向。