脑膜炎奈瑟菌菌体表面的主要成分-荚膜多糖既是细菌的毒力因子，也是一种重要的保护性抗原，是目前疫苗研制和应用的主要靶标。为建立一种简便易行的抗荚膜多糖抗体检测方法，为进一步研究及开发细菌多糖类抗体诊断试剂提供依据，本文将A群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖与卵清蛋白偶联（MenA PS-EA），以蛋白为桥梁将荚膜多糖固相化于聚苯乙烯板，建立检测抗A群荚膜多糖IgG抗体的间接ELISA法，取得良好效果。现报告如下。

脑膜炎奈瑟菌A4株，CMCC29201(中国医学细菌保藏管理中心)；卵清蛋白（egg albumin，EA）、高碘酸钠、乙烯乙二醇、硼氰化钠（美国Sigma公司）；冻干辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG（北京金豪制药有限公司）。试剂盒质量控制血清样品(河北省保定市疾病预防控制中心)，选择其中血清杀菌力实验（SBA）阳性血清作为实验室内部阳性质控血清（PC），包括：强阳性（SP），阳性（P），中等阳性（MP），弱阳性（WP），-20℃冻存。实验室内部阴性质控血清（N）经血清杀菌力实验筛选混合后分装，检测时1∶100稀释。

培养A群脑膜炎奈瑟菌至对数生长期后期，杀菌,离心,收集上清，经十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、酚、乙醇逐步提取,获得精制A群脑膜炎奈瑟菌多糖（MenA PS），真空冻干。蒸馏水溶解后采用琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B分别对多糖含量、核酸含量、蛋白含量及分子量大小（KD值）进行测定和计算，采用免疫双扩散法鉴定多糖特异性。

采用以下还原氨基法将A群脑膜炎奈瑟菌多糖（MenA PS）与卵清蛋白(EA)连接为多糖蛋白偶连物（MenA PS-EA）：调MenA PS浓度为5mg/ml（用pH为6.5的醋酸钠缓冲液溶解），加入高碘酸钠（0.1mol/L），避光搅拌4 h后加入乙烯乙二醇（0.1mol/L），搅拌1 h，以将剩余的NaIO4降解，0.001mol/L醋酸钠缓冲液（pH 4.4）透析过夜后加入卵清蛋白（pH9.6碳酸盐缓冲液预透析，MenA PS 与EA质量比为2∶1），搅拌2 h后入硼氰化钠（0.1mol/L），4℃静置过夜稳定结合物；取偶联完毕的MenA PS-EA 用Sepharose CL-4B凝胶纯化，206nm及280nm紫外检测仪检测，上样后以 AX104-1-3四通道记录仪分别对280，206nm信号进行同步采集记录；收集流洗第1峰进行多糖、蛋白、游离糖含量测定，高效液相色谱进行大分子物质纯度测定。

用矩阵滴定法选择出适宜的包被抗原及酶标抗体浓度：选2，1，0.5，0.25mg/L的多糖浓度作为MenA PS-EA的包被浓度，酶标抗体稀释度分别为1∶80、1∶100、1∶120、1∶160，ELISA法检测实验室内部阳性及阴性质控血清，当抗原包被浓度为1g/ml，酶标抗体稀释度为1∶100时，P/N值最高，故将抗原包被浓度确定为1mg/L，酶标抗体稀释度确定为1∶100。之后再进行最佳包被液、封闭液、样品孵育时间、酶标抗体反应时间的选择。

取实验室内部阳性质控血清及阴性质控血清，1∶100倍稀释，连续3 d重复检测3次，每份样品做10个复孔，检测其孔间差及日间差；将试剂盒4℃放置1，3，6，9，12个月，另37℃放置3d、7d，并与4℃放置的试剂盒做比较，检测实验室内部质控血清，观察试剂稳定性；确立Cutoff值。

血清杀菌力试验按氯化三苯四氯唑(TTC)法进行^[1]。ELISA血清滴度以≥100判定为阳性，SBA滴度以≥1:8判定为阳性，计算并评价本试剂相对于SBA的灵敏度、特异性。

图 1可见，以出峰时间为横坐标，以信号吸收强度为纵坐标，大分子结合物层析时，280和206nm监测值的增幅和降幅统一且同步，初步表明多糖和蛋白偶联效果确切。纯化物多糖含量为180.6mg/L，蛋白含量366.0mg/L，游离糖含量为1.8%，多糖、蛋白比例适当，偶联效果良好。

图 1

图 1 Sepharose CL-4B纯化多糖蛋白偶连物

图 2可见，以出峰时间为横坐标，以信号吸收强度为纵坐标，高效液相色谱检测206nm监测结果显示，纯化MenA PS-EA出峰时间为15.006min，峰面积归一法计算纯度为81.50%（n=6）。

优化反应条件后确立检测流程：纯化的MenA PS-EA用0.05 mol/L碳酸钠缓冲液（pH9.6）稀释成1μg/ml，包被聚苯乙烯微孔板，37℃2h，4℃过夜，洗涤2次，1%牛血清白蛋白（BSA）37℃封闭1h，洗涤2次，风干后铝箔袋真空包装。检测时待检血清样品用稀释液（PBS-Tween20）1:100稀释，100μl/孔，37℃30min，洗涤4次。辣根过氧化物酶（HRP）-羊抗人IgG（1:100）100μl/孔，37℃30min。加入四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，100μl/孔，37℃15min。2mol硫酸50μl/孔终止显色反应，450nm/630nm测吸光度(A)值。

图 2

图 2 MenA PS-EA高效液相色谱纯度分析(206nm)

同一样品重复3次，每次10个复孔进行检测，阳性质控变异系数(CV)值为4.26%～5.30%，标准差(S)＜0.063，说明孔间差较小。连续检测3d，S差别不大，说明日间差别不大，试剂具有良好的重复性。

本诊断试剂37℃放置7 d，4℃放置12个月均非常稳定，阳性血清和阴性血清A值比例（P/N值）基本无改变，弱阳性样品可被检出，灵敏度无变化。

取6月龄以内未接种疫苗的儿童血清58份1∶100稀释，按前述优化的ELISA条件进行检测，测得平均A450nm值（X）=0.075，s=0.015，将Cutoff值确定为X+3s，即0.12，以此值作为血清检测阳性和阴性的临界值。

血清杀菌力试验（SBA）是目前一直在沿用的用于评价机体对脑膜炎球菌免疫力的基本实验，用本试剂和SBA法分别测定样品192份。计算灵敏度（真阳性率）为96.91%，特异度（真阴性率）为90.00%，一致性为95.83%，约登指数为0.869。2种方法差异无统计学意义（χ²=3.84，P＞0.05）。

表 1

表 1 ELISA诊断试剂与血清杀菌力实验测定人血清比较

表 1 ELISA诊断试剂与血清杀菌力实验测定人血清比较

脑膜炎奈瑟菌除通过呼吸道传染引起流行性脑脊髓膜炎外，还可引起菌血症、肺炎、心肌炎等多种炎症^[2]，统称为脑膜炎奈瑟菌病。该病预后较差，故其诊断和预防引起了全世界的高度重视。到目前为止，对于脑膜炎奈瑟菌抗体检测沿用的方法主要有2种：ELISA法和SBA^{[3, 4]}。国内外的实验室一般采用单纯多糖包被，荚膜多糖提取技术已非常成熟，以不同血清型别荚膜多糖包被，可以对特异性抗体进行分群检测是其一大优点，但因荚膜多糖与常用的聚苯乙烯板的结合力较弱，造成试剂稳定性差，只能现包被现使用，故不能成为完善的试剂盒。将荚膜多糖与相应的蛋白以共价键连接作为包被抗原，以蛋白为桥梁将多糖固相化于聚苯乙烯板进行试剂研制不失为一个良好的策略。

本文以还原氨基法将MenA PS与EA进行共价连接制备成MenA PS-EA偶联物，以Sepharose CL-4B进行纯化，高效液相色谱（HPLC）测定大分子物质纯度达81.50%。取MenA PS-EA为包被抗原，建立A群脑膜炎奈瑟菌多糖特异性IgG抗体的间接ELISA法。考核结果表明，该试剂具有良好的重复性和灵敏度；与SBA比较，符合率较高。

对A群脑膜炎奈瑟菌多糖IgG抗体酶联免疫吸附试验检测试剂的研究及192份样品的检测结果表明，该试剂简便、快速、灵敏、稳定，结果可重复，尤其对大面积人群进行血清流行病学调查具有重要应用价值。在国内外尚缺乏同类应用于多糖类抗体检测方法的情况下，该诊断试剂可为相关研究提供线索。