辽宁省自1985年将流行性乙型脑炎（乙脑）疫苗纳入计划免疫后，乙脑发病率大幅降低，尤其是2000年以来一直维持较低发病率水平。2007年9月辽宁省东部某市乙型脑炎发病数急剧上升，蚊虫监测显示，乙脑主要传播媒介三带喙库蚊密度指数明显增加。为了解辽宁省乙型脑炎病毒状况及其变化，本文采用逆转录-聚合酶链式扩增（RT-PCR）分析了该地区蚊虫标本病毒分离株基因型别。现将结果报告如下。

2007年8月16日～9月1日,选择该市3个乡镇的39个畜舍，采用诱蚊灯于每天19:00～21:00采集蚊虫，采集分类后每50只为1批,装入冻存管于液氮罐中冻存。共采集77批蚊虫标本，其中74批为三带喙库蚊，其余3批为淡色库蚊。

金黄色地鼠肾细胞系（BHK-21）细胞为本实验室保存；RNA提取试剂盒（Rneasy mini kit）和胶回收试剂盒（Quick GelExtration Kit）(美国Qiagen公司)；PCR产物克隆用载体pMD19-T、JM109感受态细胞、AMV逆转录酶及TaqDNA聚合酶(日本TaKaRa公司)；其他试剂均为分析纯。

基因Ⅰ型（GⅠ）9株，其中中国参考株5株，分别为SH-53、SH-81、SH-83、SH-96和SH-101；韩国2株，为K94P05和KV1899；日本和柬埔寨各1株，分别为Ishikawa和M859。基因Ⅱ型（GⅡ）2株，为分离自马来西亚的JE827和MaSAr01994。基因Ⅳ型（GⅣ）2株，为分离自印度尼西亚的JKT7003和JKT8442。基因Ⅲ型（GⅢ）8株，其中中国参考株6株，分别为Ha-3、Beijing-1、HW、p3、SA14-14-2和SA-14；日本和印度各1株，分别为JaOArS982和GP78。西尼罗病毒（WN）分离自美国。

用Primer5Premier引物设计软件，参照SA14-14-2参考株序列，设计2对乙脑病毒特异性引物，引物序列如下：(1) JEV258:5′TAGTTTACAGCATTAGCCCCGACCA3′；JEV1584:5′CGTAAAACGCTTCAGTGTTCAGTCC3′；扩增片段长度1327bp。（2）E1300:5′TTGGTAAGGGAAGCATTGACACA3′；E2465:5′GGTCGCTAAGAACACGAGCACAC3′；扩增片段长度1166bp。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

参考文献^[1]方法，从液氮罐中取出冻存管，将蚊虫标本迅速倒人研磨器中，加入Eangle，s液1 ml清洗，吸出液体后再加入l ml Eangle，s研磨液，反复研磨至组织碎片基本消失为止。将研磨液吸入离心管，4℃，12 000 r/min离心20 min。用0.22 μm孔径滤器过滤上清液。取0.5 ml过滤液接种BHK-21细胞，置37 ℃、5%CO₂培养箱,1 h后弃去接种液体，加入7 ml细胞维持液(血清含量为2%)，细胞置于37 ℃、5%CO₂培养箱中继续培养,逐日观察细胞病变；在BHK-21细胞中连续盲传3代，弃去无病变者，将发生病变者连续传代，使之出现规律病变。

按Rneasy mini kit操作说明,从病变细胞维持液中提取病毒RNA；提取纯化后的RNA保存在-80 ℃冰箱中备用。以提取的病毒RNA为模板，分别用2种乙脑病毒特异性下游引物(JEV1584和E2465) 在AMV逆转录酶的作用下逆转录获得病毒cDNA，反应条件为42 ℃，逆转录60 min，95 ℃变性10 min。然后以病毒cDNA为模板进行PCR分析，PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR结束后，扩增的特异性片段经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定；以2对引物扩增均获得预计大小的片段为阳性判定标准。

阳性PCR产物采用Quick Gel Extration Kit回收后克隆于质粒pMDl9-T载体，转化大肠埃希菌JM109感受态细胞,通过蓝白斑筛选与菌落PCR鉴定，PCR扩增阳性的克隆由北京三博远志生物技术有限责任公司测序。采用Chen等^{[2, 3]}建立的乙脑病毒基因分型法进行基因分型。采用Blastn对数据库进行比较，序列分析为Dnastar软件。碱基配对用ClustalX软件,以西尼罗病毒为外群(outgroup)，采用Mega 3.1软件中的邻位相连法(Neighbor-joining)构建进化树，确信限度估计设为1000^[4]。

77批蚊虫标本研磨液分别接种BHK-21细胞后，共有22批细胞出现规律性病变。细胞病变集中在72 h～96 h；病变表现为聚集、圆缩和脱落；病变全部来自三带喙库蚊标本。

图 1

注：A:正常BHK21细胞（对照）；B:感染病毒的BHK21细胞 图 1 感染及未感染的BHK21细胞（×400）

从病变细胞维持液中提取病毒RNA 22株，PCR扩增结果表明，22株病毒均为乙脑病毒。

图 2

注：M：DNAMarker；1：阴性对照；2～6：病毒分离株。A:使用引物JEV258和JEV1584扩增；B:使用引物E1300和E2465扩增。 图 2 PCR扩增产物的电泳图谱

随机选择其中3株（DD14、DD17和DG47）进行基因分型。图 3可见，这3株乙脑病毒分离株同属基因Ⅰ型。

图 3

图 3 PrM基因核苷酸序列系统发生树分析

用Dnastar对此区段1233个核苷酸（978～2210）进行分析。结果显示，DD14、DD17和DG47这3株病毒之间的核苷酸及其所编码氨基酸的同源性分别为99.3%和100%。这3株病毒与广泛使用的减毒活疫苗株SA14-14-2Domain相比，共有12个氨基酸位点变异，分别位于DomainⅠ的E-138（K→E）、E-176（V→I）、E-177（A→T）位，DomainⅡ的E-107（F→L）、E-129（T→M）、E-222（A→S）、E-244（G→E）、E-264（H→Q）、E-279（M→K）位，DomainⅢ的E-315（V→A）、E-327（S→T）、E-366（A→S）位。与K94P05株相比核苷酸和氨基酸同源性分别为98.6%～99.3%和99.5%，有2个氨基酸位点变异，分别位于DomainⅡ的E-76（M→T）位和E-244（Q→E）位。与SH-53株相比，也有2个氨基酸位点变异，分别位于DomainⅠ的E-176（V→I）位和DomainⅢ的E-327（S→T）位。此外,这3株病毒与SA14-14-2株相比还有位于Domain区段外E-439（R→K）和E-447（D→G）2个氨基酸位点变异。

本文结果表明，分离自辽宁省东部某市3个乡镇蚊虫标本的22株病毒均为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒，与K94P05株（韩国）、KV1899株（韩国）、Ishikawa株（日本）、M859株（柬埔寨）、SH-53（中国）等株^[5]基因型别相同，是继2002年王俊文等^[6]从我省分离到基因Ⅰ型乙脑病毒后再次分离到基因Ⅰ型乙脑病毒。22株病毒均分离于三带喙库蚊标本，淡色库蚊标本中未分离到病毒。沿海城市监测到大量三带喙库蚊且从中分离出乙脑病毒，提示辽宁省今后几年很可能出现一个乙脑的发病高峰。

乙脑病毒E基因编码病毒包膜糖蛋白,糖蛋白的活性区域由3个Domain、411个氨基酸残基组成^{[7, 8]}。其中DomainⅢ参与受体结合，是重要的抗原决定簇；DomainⅢE-327位点又是决定抗原性的关键位点^[9]。本文结果显示，日本Ishikawa株、韩国K94P05株与疫苗株SA14-14-2Domain相比，存在E-327（S→T）位点变异。本文分离到的病毒株与SA14-14-2株相比，同样存在E-327（S→T）位点变异，提示在辽宁省首次分离到乙型脑炎病毒变异株。