中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (3): 334-336   PDF    
引用本文
刘爱群, 谢露, 龙敬伦. 海带多糖对血管内皮细胞保护作用[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(3): 334-336.
LIU Ai-qun, XIE Lu, LONG Jing-lun Effects of polysaccharide of laminaria on expression and secretion of t-PA and PAI-1[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(3): 334-336.
海带多糖对血管内皮细胞保护作用
刘爱群1, 谢露2, 龙敬伦1     
1. 广西医科大学附属肿瘤医院物理诊断中心, 南宁 530021;
2. 广西医科大学生理学教研室
收稿日期: 2007-06-25
基金项目: 广西自然科学基金(桂科自0229033);广西卫生厅立项项目(桂卫Z2001012)
作者简介: 刘爱群(1974- ),女,湖北天门人,主治医师,硕士,主要从事心血管和心电生理研究。
摘要： 目的 利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外培养模型,探讨海带多糖L01对肾上腺素刺激状态下表达和分泌的组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其抑制剂(PAI-1)的影响。 方法 体外培养人脐静脉内皮细胞系(ECV-304),随机分成6组:空白对照组,模型组,海带多糖对照组,海带多糖L01低、中、高剂量组。培养后24,48,72h采样,酶联免疫吸附法测定HUVEC培养上清液中的t-PA和PAI-1含量。RT-PCR检测t-PA和PAI-1mRNA的表达,其扩增产物经电泳后密度扫描及半定量分析。 结果 海带多糖L01各浓度组能拮抗肾上腺素的刺激作用,给药24,48h后t-PA抗原分泌明显降低,但对t-PAmRNA表达无明显影响;培养液中PAI-1含量给药48,72h后明显降低,PAI-1mRNA表达明显下调,并具有一定的量效关系。 结论 海带多糖对血管内皮具有一定保护作用,使内皮细胞表面纤溶活性增高,为其发挥抗血栓作用的机制之一。
关键词： 海带多糖     肾上腺素     组织纤溶酶原激活物(t-PA)     纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)     人脐静脉内皮细胞(HUVEC)    
Effects of polysaccharide of laminaria on expression and secretion of t-PA and PAI-1
LIU Ai-qun, XIE Lu, LONG Jing-lun     
The Affiliated Tumor Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China
Abstract: Objective To study the effects of polysaccharide from laminaria(L01)on the expression and secretion of tissue plasminogen activator(t-PA)and plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)stimulated by adrenaline in cultured human umbilical veinendo thelial cell(HUVEC). Methods With added adrenaline,six groups of human umbilical veinendothelial cell:line ECV-304 was exposed to different concentrations of polysaccharide of laminaria and cultured for 24,48 and 72 hours respectively in vitro.The levels of t-PA and PAI-1 in cultured supernatants were measured by enzyme-linked immunosorbent assay:RT-PCR was used to detect the expression of t-PA and PAI-1 messenger RNA(mRNA)in HUVEC,and the related products were examined by density scan and half-quantiative analysis after electrophoresis to reflect the variety of transcripition levels. Results Stimulated by adrenaline,the levels of t-PA and PAI-1 in cultured supernatants increased significantly.But the effect was reduced by different concentrations of L01 after cultured for 24,48 hours,the levels of t-PA decreased siginificantly,but the levels of expression of t-PA mRNA were not siginificantly different all the time.After cultured 48,72h,the level of PAI-1 decreased siginificantly,and the levels of expression of PAI-1 mRNA decreased siginificantly and dose-effect dependently. Conclusion L01 not only has the protective effect on HUEVC,but also increases fibrinolytic activity and facilitate spontaneous thrombolysis.
Key words: polysaccharide of laminaria     adrenaline     tissue plasminogen activator(t-PA)     plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)     human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)    

血管内皮细胞已证明具有多种自分泌及旁分泌功能，为体内最大内分泌器官[1]。组织纤溶酶原激活物(tissHe plasminogen activator，t-PA)和纤溶酶原激活物抑制剂-1 (Plasminogen activatorinhibitor-1，PAI-1) 主要由内皮细胞产生[2]。内皮细胞结构和功能障碍可以减弱体内纤溶系统的功能，促进动脉粥样硬化的发生与发展。因此，从保护血管内皮细胞形态和功能研究新型有效的抗血栓药物，对血栓性疾病的防治具有良好的发展前景及临床使用价值。海带多糖具有抗血栓形成作用，能保护受损血管内膜完整性[3]。本文旨在探讨肾上腺素刺激下，海带多糖对体外人脐静脉内皮细胞t-PA和PAI-1表达和分泌的影响，从内皮细胞抗血栓功能方面探讨其对心血管系统的保护作用。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞系

人脐带静脉内皮细胞系ECV-304(上海午立公司)。复苏后于37℃，5%CO2培养箱中静置培养，传至3～4代。

1.1.2 海带多糖提取物

从广西北部海湾购取海带，利用酶解碱浸提取并进一步分离纯化得一个多糖组分-L01。临用前用10%的小牛血清配成1g/L的贮液，过滤除菌，分装后40℃冰箱内保存备用。

1.1.3 主要仪器与试剂

1450超净工作台(苏州市黄埔空调净化设备有限公司)；CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)；XSB-1A倒置显微镜(梧州光学仪器厂)；450(96 well Plate Reader)酶标仪(美国Bio-Rad公司)。肾上腺素针剂(广州明兴制药厂，批号：MD2301) ；胎牛血清培养液(美国Gibico公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶(美国DIFCO公司)；琼脂糖(西班牙Biowest公司)；组织纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1) 试剂盒(上海西唐生物技术公司，批号为：0509103，0505219) ；W6701RNA抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)；K1621逆转录试剂盒(美国Fermentas公司)；PCR扩增试剂盒(美国MBI公司)；引物合成(上海生工生物公司)。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养液中t-PA和PAI-1水平测定

第3代HUVEC用10%小牛血清培养液制成1×105/ml细胞悬液，接种入24孔培养板中，37℃，5%CO2培养箱中培养24h待细胞基本融合处于对数生长期，随机分为6组，每组8孔，加入各种干预药物。实验分组：空白对照组为10%小牛血清，M-L01对照组(10μg/ml海带多糖L01) ，模型组(10μg/ml肾上腺素)，L-L01低剂量组(1μg/ml海带多糖L01+10μg/ml肾上腺素)、M-L01中剂量组(10μg/ml海带多糖L01+10μg/ml肾上腺素)、H-L01高剂量组(100μg/ml海带多糖Lol+10μg/ml肾上腺素)，分别于给药后24，48，72h收集培养液，采用酶联免疫吸附法检测培养液中的t-PA，PAI-1水平。

1.2.2 逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)

检测t-PA和PAI-ImRNA的表达细胞培养和分组方法同上，分别于给药后24，48，72h，收集细胞，提取总RNA，行RT-PCR，检测t-PA和PAI-1mRNA的表达。(1) 总RNA抽提：用W6701RNA抽提纯化试剂盒一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测定吸光度，波长A260nm/A280nm均在1.8～2.0之间，计算RNA含量。琼脂糖变性凝胶电泳鉴定RNA。(2) cDNA的合成：取RNA2μg采用AMV逆转录酶进行逆转录合成cDNA，按照反转录试剂盒说明步骤进行操作。PCR扩增：根据文献[4]设计引物。引物序列为：β-actine上游：5′-AAGCAGGAG TATGACGAGAGTCCG-3′；下游：5′-GCCTTCATACATCTCAAGTTG G-3′；t-PA上游：5′-CAGCGAGCCAAGGTGTT T-3′；下游：5′-GGCTGACCCATTCCCAAA-3′，PAI-1上游：5′-CAGACCAAGAG CCTCTCCAC-3′；下游：5′-ATCACTTGGCCCATGAAAAG-3′；反应体系为50μl；各组cDNA产物2μl，5U/μl Taq酶0.5μl，10×buffer5μl，dNTP5μl，β-actine上下游引物各1μl，t-PA或PAI-1上下游引物各1μ1，MgCl23μl，无菌双蒸水30.5μl，反应条件为94℃变性1min，61℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环。每个PCR反应重复3次。2%琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色，凝胶成像系统扫描，测目标基因和β-actine条带的灰度比值，用二者的灰度比值代表目的基因相对表达含量。

1.3 统计分析

采用SPSS 12.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果 2.1 肾上腺素和海带多糖L01对HUVEC分泌t-PA的影响(表 1)

与空白对照组比较，M-L01对照组单独作用时，对HUVEC分泌t-PA无影响(P＞0.05) 。给药24，48h后模型组培养液t-PA含量高于其他组，培养72h模型组培养液t-PA含量与其他组比较差异无统计学意义(P＞0.05) 。与模型组比较，24h低剂量的L01组未表现出明显降低t-PA水平的作用，中高剂量的L01能够使培养液的t-PA含量明显降低(P＜0.01) 。48h各浓度组的L01都能使培养液中的t-PA含量明显降低(P＜0.01) 。

表 1 肾上腺素和海带多糖L01对HUVEC培养液中t-PA含量影响(x ± s, n= 8)

2.2 肾上腺素和海带多糖L01对HUVEC分泌PAI-1影响(表 2)

与空白对照组比较，M-L01对照组单独作用时，对HUVEC分泌PAI-1无影响(P＞0.05) ；给药48，72h后模型组HUVEC培养液中PAI-1含量显著升高(P＜0.01，P＜0.05) 。与模型组比较，给药48，2h后L-L01,各剂量组均能显著抑制这种升高趋势(P＜0.01) ，表明L013个剂量均能显著抑制肾上腺素刺激内皮细胞所致PAI-1分泌增加。

表 2 肾上腺素和海带多糖L01对HUVEC培养液中PAI-1含量影响(x ± s, n= 8)

2.2.1 肾上腺素和海带多糖L01对内皮细胞t-PA及PAI-1的mRNA基因表达(图 1，图 2)

内皮细胞可以在转录水平表达t-PA及PAI-1，t-PA的mRNA PCR产物长度为409bp，PAI-1的mRNA PCR产物长度为202bp，β-actinePCR产物长度为559bp。

注：M：DNA分子量标准； 1，a，I：空白对照组； 2，b，II：模型组；3，c，III H-L01：高剂量组； 4，d，Ⅳ M-L01：中剂量组； 5，e，V L-L01：低剂量组。 图 1 各组不同时间t-PA表达的RT-PCR的检测结果

注：M：DNA分子量标准； 1，a，I：空白对照组； 2，b，II：模型组；3，c，III H-L01：高剂量组； 4，d，Ⅳ M-L01：中剂量组；5，e，V L-L01低剂量组。 图 2 各组不同时间点PAI-1mRNA表达的RT-PCR的检测结果

2.2.2 肾上腺素和海带多糖L01对内皮细胞t-PA及PAI-1的mRNA基因转录产物相对含量分析

经密度扫描半定量分析显示：各实验组和对照组比较，t-PA mRNA的表达各时间段均未见明显差异。与空白对照组比较，给药24h后各组PAI-1mRNA表达差异无统计学意义；48，72h后，模型组明显上调PAI-1mRNA的表达(0.650 8±0.025 0与0.814 2±0.069 8) (P＜0.01) 。与模型组比较，HUVEC PAI-1mRNA表达明显下调，高剂量组(0.539 6±0.044 5) ，(0.573 8±0.039 3) (P＜0.01) ；中剂量组(0.589 2±0.019 3) ，(0.578 5±0.042 9) (P＜0.05，P＜0.01) ；低剂量组72h(0.647 1±0.077 1) (P＜0.05) ，表明L013个剂量组均能在不同程度下调肾上腺素所致HVECPAI-1mRNA表达增加。

3 讨论

实验中应用儿茶酚胺类药肾上腺素刺激脐静脉内皮细胞后，24和48h培养液中t-PA含量明显增高。而联合给海带多糖L01各浓度组相同时间段t-PA含量均有不同程度的下降，且具有一定量效关系。72h培养液中t-PA含量各组均升高，但差异无统计学意义。当L01单独加入到培养液时，t-PA含量无明显影响。同时，肾上腺素刺激人脐静脉内皮细胞48h和72h，培养液中PAI-1含量明显增加，尤其以48h增高更为明显，PAI-1mRNA的表达明显上调。而联合海带多糖L01组分泌PAI-1明显减少，PAI-lmRNA明显下调。肾上腺素对PAI-1的影响是通过诱导PAI-1mRNA及其产物的表达来实现的。在心脑血管系统中，PAI-1含量的增高，血液处于高凝状态，可能会导致动脉硬化、血栓形成，这对机体是不利的。海带多糖L01通过在转录水平上影响和调节PAI-1的分泌，使PAI-1分泌减少，减少这种不利因素，防止血栓形成。因此，t-PA抗原水平和PAI-1活力对抗共同反映了纤维蛋白溶解作用和内皮功能。t-PA和PAI-1抗原的增高表示患者的纤溶功能的降低，其原因可能为血管内皮细胞受到激惹或损伤导致t-PA和PAI-1合成与释放紊乱有关[5, 6]。实验中t-PA和PAI-1含量在肾上腺素刺激下不同时间段，都不同程度有所上升，但PAI-1上升更为明显，且其合成也增加，故t-PA/PAI-1比值下降。海带多糖L01能够拮抗肾上腺素的这种作用，使t-PA/PAI-1比值升高，从而增加自发性纤溶活性，而发挥抗血栓作用。

参考文献
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