中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (3): 325-326   PDF    
引用本文
王毅, 李冰, 李昕, 徐苑苑, 孙鲜策, 金亚平, 孙贵范. 砷和香烟烟气溶液对基因Bcl/2和Bax表达影响[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(3): 325-326.
WANG Yi, LI Bing, LI Xin, et al. Effect of arsenite and cigarette smoke solution on expression of Bcl-2 and Bax[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(3): 325-326.
砷和香烟烟气溶液对基因Bcl/2和Bax表达影响
王毅1, 李冰1, 李昕1, 徐苑苑1, 孙鲜策2, 金亚平1, 孙贵范1     
1. 中国医科大学公共卫生学院, 沈阳 110001;
2. 大连医科大学基础医学院
收稿日期: 2007-06-23
基金项目: 国家自然科学基金重点项目(30530640)
作者简介: 王毅(1977- ),男,辽宁大连人,讲师,博士,主要从事环境毒理学研究工作。
通讯作者: 孙贵范
摘要： 目的 研究亚砷酸钠和香烟烟气溶液联合作用对凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的影响,并探讨它们对这2种基因表达的影响是否存在交互作用。 方法 按照2×2析因设计将大鼠淋巴细胞分为4组:亚砷酸钠单独作用组、香烟烟气溶液单独作用组、两者联合作用组和对照组。利用免疫印迹法检测细胞的Bcl-2和Bax表达,利用磷脂酰丝氨酸外翻分析法检测各组细胞凋亡,同时采用2×2析因设计的方差分析研究两者的交互作用。 结果 亚砷酸钠和香烟烟气溶液单独作用或者联合作用都能够使细胞Bcl-2蛋白表达减少、Bax蛋白表达增加、凋亡细胞数增加。析因设计的方差分析结果表明,2种毒物对Bcl-2蛋白表达、Bax蛋白表达、凋亡细胞数均存在交互作用,交互作用方式为协同作用。 结论 亚砷酸钠和香烟烟气溶液对大鼠淋巴细胞的Bcl-2蛋白表达、Bax蛋白表达的影响存在交互作用,交互作用方式为协同作用。
关键词： 亚砷酸钠     香烟烟气溶液     Bcl-2     Bax     交互作用     协同作用    
Effect of arsenite and cigarette smoke solution on expression of Bcl-2 and Bax
WANG Yi, LI Bing, LI Xin, et al     
School of Public Health, China Medical University, Shenyang 110001, China
Abstract: Objective To investigate the effect of sodium arsenite combined with cigarette smoke solution on expression of Bcl-2 and Bax in rat lymphocytes and study their interaction. Methods According to 2×2 factorial design,rat lymphocytes were divided into 4 groups:sodium arsenite treated group,cigarette smoke solution tr eated group,sodium arsenite and cigarette smoke solution treated group and control group.After the exposure,protein expression of Bcl-2 and Bax in rat lymphocytes was detected by western blotting;Apoptosis of rat lymphocytes was detected by flow cytometry.ANOVA of 2×2 factorial design was used to evaluate the interaction. Results When sodium arsenite treatment and cigarette smoke solution treatment were used together or separately,protein expression of Bcl-2 decreased;Protein expression of Bax and the number of apoptotic cells increased.ANOVA of the factorial design showed that sdium arsenite and cigarette smoke solution had interactions on protein expression of Bcl-2,Bax and the number of apoptotic cells.The interactions were synergistic. Conclusion Sodium arsenite and cigarette smoke solution have interactions on protein expression of Bcl-2 and Bax.The interactions are synergistic.
Key words: sodium words     arsenite     cigarette smoke solution     Bcl-2     Bax     interaction     synergis    

砷是自然环境中广泛存在的一种类金属元素。过量的砷通过饮水、食物、空气等进入人体引发的砷中毒是全球所关注的严重的公共卫生问题之一[1]。高砷暴露人群中有相当一部分人吸烟。高砷暴露和吸烟均可引发多个组织系统的同种疾病，所以高砷暴露和吸烟对疾病的发生是否有协同作用值得研究。细胞凋亡是机体清除衰老损伤细胞，维持组织正常生理功能的一种有效机制。但是很多外界理化因素能诱导细胞的非正常凋亡，进而导致多种疾病的发生[2]。Bcl-2家族是最重要的凋亡调节因子之一，其中Bcl-2和Bax分别是主要的抗凋亡和促凋亡成员。本研究通过亚砷酸钠和香烟烟气溶液(cigarette smoke solution，CSS)联合作用于大鼠淋巴细胞，观察基因Bcl-2、Bax的蛋白表达及细胞凋亡发生情况。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器

NaAsO2(上海试剂二厂，分析纯)；香烟(市售，南方某卷烟厂)；淋巴细胞分离液(中国医学科学院生物工程研究所)；小鼠抗Bcl-2单克隆抗体、小鼠抗Bax单克隆抗体、羊抗Actin多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；辣根酶标记兔抗山羊IgG、山羊抗小鼠IgG(北京中山生物技术有限公司)；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)；流式细胞仪(FACSClibur，美国BD公司)；转移电泳槽、垂直电泳槽及电泳仪(美国Bio Rad公司)。

1.2 大鼠淋巴细胞的分离

Wistar雄性大鼠体重(250±20)g，经腹主动脉采血7ml，梯度密度离心法分离淋巴细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，调节细胞浓度至3×106个/ml左右备用。

1.3 香烟烟气溶液的制备

参照Bachelet等的方法[3]，模拟人类吸烟方式有所改动，2个串联的大包氏管各装有5ml PBS(pH 7.2)作为吸收液，一端连接香烟，另一端连接注射器，2s内抽吸35ml，间歇58s后再吸，吸烟1支，制成0.1支/ml的CSS立即作用于细胞。

1.4 细胞染毒

按照2×2析因设计分别给予4组细胞不同终浓度的亚砷酸钠和CSS：对照组(亚砷酸钠0μmol/L，CSS0支/ml)，亚砷酸钠单独作用组(亚砷酸钠20μmol/L，CSS0支/ml)，CSS单独作用组(亚砷酸钠0μmol/L，CSS 8×10-3支/ml)。亚砷酸钠和CSS联合作用组(亚砷酸钠20μmol/L，CSS 8×10-3支/ml)。以RPMI 1640培养基，37℃、5% CO2培养2h。

1.5 Bcl-2、Bax蛋白表达的检测

提取细胞总蛋白后进行蛋白电泳，然后将蛋白转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，封闭PVDF膜。分别加入适当比例稀释的小鼠抗Bcl-2单克隆抗体(1∶500)，小鼠抗Bax单克隆抗体(1∶200)杂交，然后加入各自相应的二抗再次杂交。化学发光反应后曝光、显影、定影，扫描并用ImageJ成像分析系统定量分析。同时检测Actin的蛋白表达以校正目标蛋白表达。

1.6 细胞凋亡的检测

参照试剂盒说明书进行。细胞染毒后用冷PBS洗2次，将细胞重悬于binding buffer中，分别加入Axmexin V-FITC和碘化丙啶染液，用流式细胞仪检测10000个细胞，用Cell Quest软件分析计数细胞散点图各相限细胞数。

1.7 统计分析

采用SPSS11.0统计软件进行方差分析。

2 结果 2.1 Bcl-2的蛋白表达情况

亚砷酸钠和CSS单独作用或者联合作用均可使细胞内的Bcl-2蛋白表达减少，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。联合作用组的Bcl-2蛋白表达显著低于2个单独作用组(P＜0.05)。Bcl-2的蛋白表达情况的变化规律为：对照组>亚砷酸钠单独作用组>CSS单独作用组>亚砷酸钠和CSS联合作用组。

2.2 Bax的蛋白表达情况

亚砷酸钠和CSS单独作用或者联合作用均可使细胞内的Bax蛋白表达增加，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。而联合作用组的Bax蛋白表达显著高于2个单独作用组(P＜0.05)。Bax的蛋白表达情况的变化规律为：亚砷酸钠和CSS联合作用组>CSS单独作用组>亚砷酸钠单独作用组>对照组。

2.3 细胞凋亡结果(表 1)

亚砷酸钠和CSS单独作用或者联合作用均可使发生凋亡的细胞数增加，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。联合作用组的凋亡细胞数显著高于2个单独作用组(P＜0.05)。发生凋亡的细胞数的变化规律为：亚砷酸钠和CSS联合作用组>CSS单独作用组>亚砷酸钠单独作用组>对照组。

表 1 亚砷酸钠和CSS单独作用、联合作用时细胞凋亡发生情况

2.4 2×2析因设计方差分析结果(表 2)

亚砷酸钠和CSS对细胞内Bcl-2蛋白表达减少存在交互作用(F=7.62，P＜0.05)，而且联合作用组Bcl-2蛋白表达减少量(0.9547)大于2个单独作用组Bcl-2蛋白表达减少量之和(0.7737，减少量为染毒组Bcl-2蛋白表达量和对照组Bcl-2蛋白表达量的差值的绝对值)，由此可以判断该交互作用为协同作用。亚砷酸钠和CSS对细胞内Bax蛋白表达增加存在交互作用(F=81.21，P＜0.05)，而且联合作用组的Bax蛋白表达增加量(31.26)大于2个单独作用组Bax蛋白表达增加量之和(19.59，增加量为染毒组Bax蛋白表达量和对照组Bax蛋白表达量的差值)，由此可判断该交互作用是协同作用。亚砷酸钠和CSS对凋亡细胞数的增加存在交互作用(F=10.39，P＜0.05)，而且联合作用组的凋亡细胞数增加量(789.42)大于2个单独作用组凋亡细胞数增加量之和(507.54，增加量为染毒组凋亡细胞数和对照组凋亡细胞数的差值)，由此可判断该交互作用是协同作用。

表 2 凋亡相关指标的2×2析因设计方差分析结果

3 讨论

基因Bax和基因Bcl-2是Bcl-2家族的代表成员。Bcl-2蛋白是一种膜结合蛋白，存在于细胞中的线粒体、核膜等处，其主要功能是抑制细胞凋亡，延长细胞寿命。而Bax是Bcl-2的同源蛋白，能够促进细胞凋亡，并能抑制Bcl-2的效应。本研究结果显示，亚砷酸钠和CSS单独作用或联合作用皆能够使Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少，而且Bax蛋白表达增加、Bcl-2蛋白表达减少的趋势与细胞凋亡发生的趋势一致。进一步分析发现，亚砷酸钠和CSS对Bcl-2蛋白表达、Bax蛋白表达存在交互作用，交互作用方式为协同作用；两者对凋亡细胞数亦存在交互作用，交互作用方式为协同作用。亚砷酸钠和CSS对抑制凋亡基因Bcl-2的表达、促凋亡基因Bax的表达存在的协同作用可能是两者对细胞凋亡存在协同作用的内在机制之一。

本研究组以前的研究发现，亚砷酸钠和CSS单独作用或联合作用皆能够使大鼠淋巴细胞发生氧化应激，而且两者对氧化应激的多个相关指标具有协同作用[4]。这种在诱发氧化应激和凋亡上的一致性可能是因为细胞凋亡和氧化应激有着紧密的联系，活性氧已经被证实了能够诱导体外培养的多种细胞发生凋亡，而过氧化氢还原酶、谷胱甘肽等抗氧化物能够抑制这种凋亡的发生[5]。活性氧可以直接促使线粒体膜上的孔道开放，引起线粒体去极化，导致细胞色素C的泄漏，激活caspase-9和caspase-3，最终促发细胞凋亡[6]。

流行病学调查发现，高砷暴露的吸烟者肺癌发生率、膀胱癌发生率、心血管疾病的发生率都有显著的增加[7-9]。而本研究结果表明，亚砷酸钠和CSS对凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的影响确实存在交互作用，作用方式为协同作用。这种的协同作用是否就是导致上述疾病发生率显著增高的原因之一，有待进一步研究。

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