2008, Vol. 24
2. 现工作在深圳市福田区疾病预防控制中心, 518040;
3. 深圳市福田区慢性病防治院;
4. 深圳市疾病预预防控制中心;
5. 深圳市公安局强制戒毒所
滥用毒品是一个全球性重大的公共卫生和社会问题。海洛因是国内吸毒人群滥用的主要毒品。近年来,海洛因滥用人数急剧上升,对人体健康造成严重伤害。过去的30 年中,已经建立数种成瘾者治疗方案,但多数治疗不充分,成瘾者戒毒后很快复吸。海洛因成瘾所造成的生物学改变主要是蛋白质改变。海洛因吸食者血液中是否有特异性蛋白质改变,即存在蛋白质标志物,将决定是否可用实验室检测鉴别海洛因吸食者及其成瘾状况。双向电泳(2DE) 技术是目前蛋白质分离的核心技术。2DE 对低丰度蛋白的检测虽有不足,但可以通过剔除高丰度蛋白和蛋白质预分级从而增加低丰度蛋白上样量而克服[1]。本研究利用蛋白质组学方法比较海洛因成瘾者和健康对照蛋白质组差异,为寻找海洛因成瘾标志物提供基础数据。结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂Ettan IP Gphor I EF 系统,预制胶条、蛋白定量试剂盒,3 - [3 - (胆酰胺基丙基) 二甲氨基] 丙磺酸盐(CHAPS) 、两性电解质(美国GE 公司) ;Albumin/ IgG剔除试剂盒、复合蛋白酶抑制剂( Protease Inhibitor Cocktail Set V ,EDTA - Free) (美国Merck 公司) ;离心式脱盐柱(美国Peirce公司) ;4700 串联飞行时间质谱仪(美国Applied Biosystems 公司) ;超纯尿素、硫脲、二硫苏糖醇(Dithiothreitol ,DTT) 、低熔点琼脂糖、十二烷基磺酸纳(SDS) (德国Sigma 公司) 。
1.2 溶液(1) 样品缓冲液:8 mol/ L 尿素,4 %CHAPS ,用前加入0.4 %两性电解质。(2) 平衡液:储液为0.375 mol/ L Tris- HCI (pH8.8) ,20 %(V/ V) 甘油,6 mol/ L 尿素,2 %十二烷基磺酸纳(SDS) ;分装后- 30 ℃保存。用前储液加2 %DTT 为平衡液I ,储液加碘乙酰胺2.5 %为平衡液II。
1.3 样品制备将EDTA 抗凝采血管用前加50μl 蛋白酶抑制剂的100 ×储存液(每管蛋白酶抑制剂用前加1 ml 水,得到100 ×储存液) 。采空腹肘静脉血2～3 ml ,轻轻混匀,在4 h 内3 000 g 离心10 min 取上层血浆分装,- 70 ℃保存。共采集5名男性海洛因吸食者和5 名男性健康对照者血浆。吸食海洛因者平均吸食时间2 年,最长8 年,最短14 个月。2 组之间体重、身高、年龄差异无统计学意义。所有供血者肝功能正常,血浆乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒抗原抗体检测均为阴性。取每份血浆60μl ,用Albumin/ IgG剔除试剂盒同时除去血浆白蛋白和IgG,合并洗脱液,经CHRIST 冻干机冷冻干燥,重新溶解于100μl 样品缓冲液。用离心式脱盐柱进行蛋白质脱盐和缓冲液置换。用蛋白定量试剂盒准确定量。
1.4 双向电泳等电聚焦用13cm pH 4～7 胶条,上样量为600μg ;上样体积为250μl 。聚焦程序设为: 30V13 h ,500V1h ,1 000 V 1 h ,80 000 V 聚焦48 000V/ h 后,500 V 保持。平衡和二向电泳,参照文献[2]方法。
1.5 染色、图像分析胶体考马斯亮蓝染色按文献[3]进行。
分子量和等电点。经群组分析差异1.5 倍以上的蛋白点定为差异蛋白点(某单个点的吸光度占胶上全部点吸光度总和的百分比(即吸光度体积百分比) 的组均值相差1.5 倍以上,高值组最低值高于低值组最高值的蛋白点) 。
1.6 差异蛋白胶内酶解手工挖取差异蛋白点,经乙腈- 碳酸氢铵脱色后干胶排出乙腈:加入5～10μl 浓度为12.5 ng/μl的胰蛋白酶溶液,4 ℃冰箱中约30 min ,后在37 ℃烘箱中酶解过夜。酶解后以50 %乙腈+ 0.1 %三氟乙酸溶液60μl ,作用30～40 min ,提取肽段,将溶液转移到新的96 孔板内。重复2～3 次。将肽段溶液在N2 流下吹干浓缩,以备用于质谱鉴定。
1.7 飞行时间串联质谱鉴定蛋白将完全干燥的肽段重新溶解于0.7μl 0.5 g/ L 氰基肉桂酸90 溶液(溶剂为50 %乙腈+ 0.1 %三氟乙酸溶液) 中,并将其全部点到不锈钢基质辅助激光解吸靶板上,并在室温下自然干燥。样品用4 700 串联飞行时间质谱仪4 700 Proteomics Analyzer 进行质谱分析,激光源为355 nm 波长的Nd : YAG(掺钕钇铝石榴石) 激光器,加速电压为20 kV ,采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。肽质量指纹谱( PMF ) 质量扫描范围为700～3 500 Da ,选强度最大的5 个峰进行串级质谱(MS/ MS)分析;谱图用肌红蛋白(Myoglobin) 酶解肽段进行外标校正,数据用美国Applied Biosystems 公司GPS 软件生成文件提供给MASCOT(Matrix Science ,London ,U K) 软件[4]进行数据库检索。参数设置:数据库为NCBInr ;数据检索的方式为com2bined ;最大允许漏切位点为1 ;酶为胰蛋白酶。质量误差范围设置:PMF 0.3Da ,MS/ MS 0.4Da ;在数据库检索时胰酶自降解峰和污染物质的峰都手工剔除。靶标蛋白得分78 分以上(95 %CI 以上) 确定结果。
2 结 果 2.1 血浆白蛋白和IgG处理效果(图 1)血浆蛋白经过吸附白蛋白和IgG处理,冷冻干燥重新溶解于含8 mol/ L 尿素、4 %CHAPS 的溶液中,再经过除盐过程后双向电泳获得理想的重复性很高的2D - 图谱,同一样本2 次电泳斑点一致率达83 % ,在pH4～7 的范围内斑点数目达到563 ±23 ,较好的展示了中高丰度蛋白。
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注:等电聚焦在13 cm ,pH 4～7 胶条上8 000 V 进行48 000Vh。胶体考马斯亮蓝G- 250 染色。 图 1 吸附白蛋白和IgG后的血浆蛋白双向电泳图 |
2.2 双向电泳结果(表 1)
按照吸光度体积百分比均值相差1.5 倍以上,低值组最大值不高于高值组最小值的原则分析2组凝胶斑点。2 组样本之间一致性较高,组间差异少。仅见5个组间差异点。其中在吸毒组上调点3 个,下调点2 个。
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表 1 差异蛋白点吸光度体积比( %) |
2.3 差异蛋白鉴定(表 2)
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表 2 差异蛋白鉴定结果 |
3 讨 论
本研究应用血浆Albumin/ IgG去除试剂盒,有效去除了占血浆蛋白80 %的血浆白蛋白和IgG类免疫球蛋白,消除了它们对中低丰度蛋白的遮蔽。双向电泳后采用改进的胶体考染[3]显示胶中蛋白点,获得了较为理想的实验结果,在pH 4～7 的范围内斑点数目达到563 ±23 。胶体考染具有接近于普通银染的高敏感性,且操作简单,结果一致性高于银染,适合质谱分析。利用串联质谱结果进行蛋白鉴定较单纯利用PMF 鉴定可靠[4]。本研究采用4700 串联质谱鉴定差异蛋白,并利用GPS - MASCOT 软件进行数据库检索鉴定蛋白。所有选定的斑点全部鉴定成功,鉴定结果可靠。
本研究将海洛因成瘾者与正常对照者血浆双向电泳图谱(pH 4～7) 进行对比分析。为了避免个体差异,设定差异斑点须满足条件:光密度体积百分比组间均值相差1.5 倍以上,低值组最大值低于高值组最小值吸光度。共找到5 个差异斑点,经串联质谱鉴定为:γ纤维蛋白原(平均上调5 倍) :α- 1B糖蛋白(下调1.8 倍) ;α- 抗胰蛋白酶原(上调215 倍) ;视黄醇结合蛋白载体蛋白单体(下调2.0 倍) ;铜蓝蛋白(上调6.6倍) 。
纤维蛋白[5]、人α- 抗胰蛋白酶[6]、铜蓝蛋白[7]均是急性期的反应蛋白,构成机体非特异性抗病能力。上述3 个蛋白在海洛因成瘾者上调,推测可能与吸食毒品(杂质) 致肝脏损伤的代偿性修复加强有关。人α- 1B 糖蛋白(α- 1 - B - gly2coprotein - human)[8]可能与免疫和细胞黏附的分子识别有关。海洛因吸食者下调的生物学含义尚不清楚。
视黄醇结合蛋白载体蛋白( Transthyretin) 又称前白蛋白(Peralbumin) 或转甲状腺素蛋白。该蛋白在脑内是由脉络丛产生、分泌和调节[9,10],占脑脊液总蛋白的25 % ,出生前后甚至更高,说明该蛋白与中枢神经发育有重要关系。额颞叶痴呆病人主要临床表现人格和社会行为异常,Transthyretin 上调[11],进一步提示该蛋白与认知记忆功能相关。在晚期阿尔茨海默症(AD) 病人该蛋白水平下降[12]。本室早期通过单光子发射断层扫描显像研究发现AD 患者与海洛因吸毒者有相似表现[13],提示两者具有相近的神经系统损伤。但血浆中Transthyretin 是由肝脏分泌[14],本研究中Transthyretin 单体在海洛因成瘾者血浆中下调,是否反映了海洛因吸毒者脑脊液中Transthyretin 的变化规律值得深入研究。
本研究分析pH 4～7 范围的血浆蛋白质组,显示海洛因成瘾者与正常人有差异。进一步扩展到pH 6～11 的范围将会发现更多的差异蛋白。本研究鉴定的差异蛋白包括Transthyretin ,似与海洛因所致滥用者神经系统损伤有关。
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