血清总铁结合力(TIBC)是指血清转铁蛋白可结合全部铁的能力，其含量高低与缺铁性贫血、急性肝炎等疾病的发生发展密切相关。目前测定TIBC的方法需要沉淀、离心等步骤，无法应用于全自动生化分析仪^[1]。本文参考文献[2-4]，在建立以2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[(N，N一二羧基甲基)氨基]苯酚(5-Br-PADCAP)为显色剂，可直接应用于全自动生化分析仪的三试剂血清总铁结合力(TIBC)测定法。结果表明，用该法测定血清TIBC，血清标本无需任何处理即可用于自动分析，具有快速、灵敏、线性范围宽、测定试剂稳定等特点，适合推广应用。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

(1) 仪器：UV-2201紫外分光光度计(日本岛津公司)；Beckman LX-20全自动生化分析仪；pH-3C酸度计(上海雷磁分析仪器厂)。

1.2 试剂

总铁结合力标准品：100μmol/L(维日康生物技术有限公司)；试剂1含pH8.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HC1) 80μmol/L、曲拉通X-100(TritonX-100) 5ml/L、NaHCO3 120mmol/L、硫酸亚铁氨及掩蔽剂适量；试剂2含2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[(N，N-二羧基甲基)氨基]苯酚(5-Br-PADCAP)350mg/L、曲拉通X-100(TritonX-100) 5ml/L、维生素C 5g/L。试剂3含pH 4.5的HAc-NaAc缓冲液150mmol/L，盐酸胍80g/L。

1.3 原理

(1) 在pH 8.6Tris-HC1缓冲液中，过量的铁离子将血清中未与铁结合的转铁蛋白全部饱和。(2) 5-Br-PADCAP与缓冲液中未与转铁蛋白结合的铁离子发生灵敏的显色反应，记录反应体系的吸光度A₁。(3) 血清铁从转铁蛋白全部解离开来并与5-Br-PADCAP发生灵敏的显色反应，记录反应体系的吸光度A₂，吸光度的变化值△A与总铁结合力成正比。

1.4 Beckman

LX-20全自动生化分析仪参数标准液浓度100μmol/L；2点终点法：37℃；主波长546nm，次波长700nm；样品量10μl；试剂1量200μl，试剂2量50μl；试剂3量30μl；测定时间：加试剂2后5min测吸光度A₁，再加入试剂后35min测吸光度A₂。计算公式：血清TIBC浓度(μmol/L)=A_U/A_s×100。

2 结果 2.1 吸收光谱

以试剂空白为参比，测得标准管、测定管的络合物最大吸收波长均在557nm处，与之靠近的546nm为自动分析法的测定主波长。

2.2 反应终点时间及显色稳定性

按本法操作，加入试剂2和试剂3后测定体系中的Fe²⁺,均可在4.5min内与2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-[(N，N-二羧基甲基)氨基]苯酚(5-Br-PADCAP)显色完全并至少稳定30min。

2.3 酸度选择

酸度的选择兼顾5-Br-PADCAP与Fe²⁺的显色灵敏度及转铁蛋白与铁的结合能力。结果表明，5-Br-PADCAP与Fe²⁺在pH 4.0～9.0范围内形成稳定络合物；转铁蛋白与铁在pH 8.3～8.8形成稳定络合物，pH＜8.2时转钙蛋白与铁的结合能力显著下降。试剂1和试剂2的pH选择为8.6。加入试剂3目的是使血清铁快速从转铁蛋白中解离开来，选择150mmol/L、pH4.5的HAc-NaAc缓冲液可满足此要求。

2.4 标准曲线

取已测得TIBC为195μmol/L的总铁结合力血清标本，倍比稀释后进行线性测定。结果表明，本法线性范围至少可达195μmol/L，回归方程为Y(测定值)=1.0233×(测量值)-0.94;相关系数r=0.9991。

2.5 回收试验

取已测得TIBC含量为74.1μmol／L的混合血清标本分别加入35.8，71.6，107.4μmol/L的TIBC标准品进行回收试验。回收率分别为97.2%，98.4%，102.5%，平均回收率为99.4%。

2.6 精密度

将1份混合血清分为20份，按本法测定，测得血清TIBC平均值分别为67.4μmol/L，批内变异系数(CV)0.026。另取1混合血清连续测定12d，每天平行2次，测得血清UIBC平均值为71.3μmol/L，批间为0.043。

2.7 方法对比试验

采用文献[1]方法和本法分别测定86例血清标本，前法(X)测得平均值为69.7μmol/L；本法测得平均值为70.7μmol/L。回归方程为Y=0.9973X+1.53，r=0.9765，经f检验，两者差异无统计学意义(P＞0.05) 。

2.8 干扰试验

在本法测定条件下，胆红素含量＜520mg/L、血红蛋白含量＜9g/L、甘油三酯含量＜5.80mmol/L、Zn2+含量＜60μmol/L、Cu²⁺含量＜50μmol/L、Ca²⁺含重＜5.5mmol/L、Mg²⁺含量4.5mmol/L,均不产生干扰，血清中其他常量和微量元素10倍量不产生干扰。

2.9 参考值

选择102名体检合格成年人。男52名，女50名,年龄18～60岁。空腹静脉采血，用本法测得血清TIBC含量分别46.5～75.3和52.5～76.4μmol／L。

3 小结

本文结果表明，本方法可避免传统碳酸镁沉淀法^[1]测定血清TIBC需要沉淀、离心、只能手工法操作的缺点，适合在实验室开展使用。

前期研究中，我们己分别建立了以5-Br-PADCAP为显色剂的血清铜^[5]、锌^[6]、铁^[7]测定方法，本文应用5-Br-PADCAP为显色建立了血清TIBc自动分析法。结果表明，本法灵敏度高、线性好，是一种颇具推广应用前景的新方法。操作时应注意防止铜、锌、铁等微量元素的污染，所用吸管、试管必须经10%盐酸或硝酸浸泡过夜，洗净干燥后备用。用自动分析法测定血清TIBC时，应设计最佳的分析顺序^[8]，防止试剂针交叉污染，尤其是在用双缩脲试剂测定总蛋白后，比色杯和试管壁上吸附有高浓度的Cu²⁺，难以用蒸馏水洗净，易使测定结果偏高。