肝硬化是肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴有肝细胞结节状再生，是肝细胞在多种因素作用下反复损伤的慢性病理过程。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)是多种免疫细胞集合体，含多种免疫活性细胞，分泌产生多种细胞因子。白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8) 为1987年第一个被发现并克隆的CXC家族(C为半胱氨酸，X为任意氨基酸)趋化因子^[1]，有ELR⁺结构，是潜在的血管生成因子。为了解IL-8在介导肝硬化发病机制中的作用，筛选29例慢性乙肝后肝硬化患者，检测外周血IL-8及其mRNA水平。现将结果报道如下。

我校教学医院2005年9月～2006年12月收治的HBV感染后肝硬化患者，其中男20例，女9例，平均年龄(44.5±8.9) 岁，其中代偿期17例，失代偿期12例，HBV-DNA(+)10例，丙氨酸转氨酶(ALT)升高13例，天冬氨酸转氨酶(AST)升高15例，AST/ALT>1.017例，临床诊断符合2005年全国病毒性肝炎会议修订诊断标准^[2]，病程均超过6个月，无合并HAV、HCV、HDV、HEV、HIV感染及其他自身免疫性疾病，3个月内未系统使用抗病毒和免疫抑制剂治疗。另选25名本市中心血站体检正常献血员为对照组，其中男16名，女9名，平均年龄(32.0±9.1) 岁。

聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)(上海试剂二厂)；HBV-DNA诊断试剂(上海中亚基因研究所)；ELISA法 IL-8试剂盒(法国DLACLONE公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；cDNA合成试剂(上海申能博采生物科技有限公司)；半自动生化仪-ECOM-F6124(德国eppendorf公司)；EXL808全自动酶标仪和EXL-50X全自动洗板机(美国Bio-Tek公司)；LightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenⅠ(德国Roche公司)；iCycle(R)荧光实时定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

分批采取患者晨起空腹静脉血5ml，分别置2支含肝素的无菌eppendorf管和2支洁净的eppendorf管。肝素抗凝血以Ficoll-Hypaque常规分离PBMC，普通管常规分离血清备检。

取100μl待测血清加入等体积的细胞裂解液，提取HBV-DNA模板，采用荧光定量PCR法，按照试剂盒说明操作。HBV上游引物(5′→3′)：ACT GTT CAA GCC TCC AAG CTG，下游引物(5′→3′)：CCC GAG ATC TTC TGC，扩增片段长度600bp。扩增参数为94℃预变性5min，然后94℃ 50s，55℃40s，72℃ 90s，循环35次，72℃延长4min，4℃保存，琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下判断结果。

采用ELISA法。以试剂盒提供标准品绘制标准曲线，每批检测设空白、阴性、阳性对照各2孔，取100μl待测血清和100μl辣根过氧化物酶标记的抗趋化因子单克隆抗体，加至包被有相应趋化因子单克隆抗体的酶标反应板孔内，37℃孵育1h，磷酸盐(PBS)缓冲液洗涤5次，加100μl底物3-3甲基苯并噻唑啉-6-磺酸盐，室温30min，加2mol/L H₂SO₄终止反应，在EXL808全自动酶标分析仪上(450±2) nm处读取吸光度(A)值，每孔测定2次，取均值，依标准曲线确定血清IL-8含量。

mRNA检测采用Real-time PCR法。将抗凝血用等量无Ca²⁺、Mg²⁺的Hank's液稀释，分离的PBMC以1640完全培养液调整细胞数至(1～2) ×109个/L悬液，以Trizol试剂抽提PBMC总RNA，并逆转录为cDNA，置-86℃冰箱备检。以SYBR GreenⅠ荧光标记法检测PCR产物，总反应体系为25μl，包括上下游引物各0.4mmol/L，MgCl₂ 2.5mmol/L，Ex-Taq 1.25U，dNTPs,2mmol/L 1×PCR buffer (500mmol/L KCl,100mmol/L Tris,20μg/L gelatin,pH 8.3) ，2×SYBRTM GreenⅠ液。2μl标准品或模板cDNA，模板cDNA以1∶5稀释。趋化因子引物设计参照Hirata等方法进行^{[3, 4]}，IL-8上游引物(5′→3′)：CTT TGT CCA TTC CCA CTT CTG A，下游引物(5′→3′)：TCC CTA ACG GTT GCC TTT GTA T，扩增片段长度306bp；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游引物(5′→3′)：ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC，上游引物(5′→3′)：TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA，扩增片段长度452bp。PCR 扩增反应参数如下：95℃预变性300s，然后95℃ 50s，55℃ 40s，72℃ 90s共35个循环，最后72℃延伸300s。为克服系统误差以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为参照,以log cDNA/log GAPDH比值代表其mRNA水平。

以GAPDH为对照，将起始浓度为(10⁶ copies/μl)的GAPDH，按1:10设6个梯度浓度稀释，即10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，0copies/μl。

IL-8含量及其mRNA水平以x±s表示；采用SPSS 11.5软件进行t或t′检验；Excel进行相关分析。

HBV感染后的肝硬化患者血清内IL-8水平及PBMC内IL-8 mRNA含量均显著高于正常对照组(P＜0.01) ，且失代偿期略高于代偿期。

图 1

图 1 肝硬化患者外周血IL-8及其mRNA水平

图 2

注：1,2：对照者；3,4：患者1；5,6：患者2。1,3,5：GAPDH；2,4,6：IL-8。 图 2 PBMC内IL-8mRNA表达

mRNA相关性肝硬化患者血清内IL-8水平与PBMC内IL-8 mRNA表达相关(r=0.5465,P＜0.005) 。

29例肝硬化患者中HBV-DNA(+)组血清内IL-8含量及PBMC内IL-8 mRNA表达水平均高于HBV-DNA(-)组(P＜0.01,P＜0.05) 。

图 3

图 3 IL-8及其mRNA与HBV-DNA关系

根据ALT、AST水平将患者分为ALT、AST正常组、升高组。IL-8及PBMC IL-8 mRNA水平与ALT及AST显著相关(P＜0.05或P＜0.01) ，且AST/ALT>1.0组高于AST/ALT≤1.0组(P＜0.05或P＜0.01) 。

图 4

图 4 IL-8及其mRNA表达水平与转氨酶关系

IL-8是一种具有高度活性的小分子多肽，可由多种免疫细胞如单核-巨噬细胞、T淋巴细胞及中性粒细胞以及HBV感染的肝细胞等分泌，LPS、IL-1、TNF-α可刺激其大量表达^[5]，通过对中性粒细胞及T细胞、单核细胞的趋化作用，本研究结果显示，HBV感染后肝硬化患者血清IL-8表达水平显著增高，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.01) 。肝硬化失代偿期IL-8及其mRNA的表达略高于代偿期，肝细胞受损加重，全身高动力循环，门脉高压，多系统受累，IL-8增高，间接激活肝星形细胞，胶原沉积，结缔组织增生，影响肝硬化的病理进程。采用Real-time PCR检测发现，肝硬化患者PBMC内IL-8 mRNA表达水平升高，与血清蛋白表达水平具有一致性，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01) ，提示PBMC中IL-8 mRNA高表达可能是导致血清IL-8水平升高的主要原因。Mahe等^[6]研究发现，HBV-x蛋白转染细胞可刺激IL-8 mRNA及其蛋白水平表达增强。因此，检测PBMC中IL-8 mRNA的表达对了解肝脏的损伤程度有重要意义，可为肝损伤的早期诊断提供依据。

实验结果显示，肝硬化患者病毒复制组IL-8及其mRNA表达水平与非复制组相比较，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01) ，提示IL-8表达水平与病毒复制诱导的局部炎症反应程度有一定关系。HBV除可诱导肝细胞合成大量的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)外，还可作为TNF-α强刺激剂，直接诱导单核巨噬细胞产生TNF-α，升高的TNF-α可进一步诱导肝细胞、Kupffer细胞及PBMC、内皮细胞合成和释放大量IL-8，扩大其生物学效应。

实验结果显示，肝硬化患者IL-8及其mRNA的含量与ALT、AST水平呈正相关，表明IL-8的表达水平在一定程度上反映肝硬化的炎症活动状况，对了解肝硬化的进展有重要意义。肝细胞损伤主要来自宿主的免疫应答^[7]，HBV感染机体内免疫复合物增加，刺激机体产生大量的TNF-α、IL-6等前炎症因子，这些因子本身可诱使肝脏微循环障碍，血液通透性增加，全身高动力循环，肝细胞水肿变性，继而坏死，ALT、AST大量释放入血，并可刺激IL-8表达增强。肝硬化患者肝功能异常，功能性肝细胞数目及活性减少，使趋化因子的分解代谢障碍，可能是IL-8增加的重要原因。

综上所述，HBV感染后肝硬化患者外周血IL-8及其mRNA水平升高，通过趋化中性粒细胞、单核细胞等，释放促炎性细胞因子，引起炎症反应，并在清除肝炎病毒的同时，刺激纤维组织增生，加重肝细胞损伤和炎症反应。