丝素是一种源于蚕丝的天然高分子纤维蛋白质，具有良好的生物相容性，目前应用于组织工程材料领域，如人工皮肤、手术缝合线、药物控释载体等^[1]。其成型工艺中使用甲醇作为交联固化剂。因此，成品中可能有微量甲醇残留。甲醇在体内有蓄积作用且毒性较大^[2]，甲醇检验首选方法为气相色谱法，但因甲醇存在于固态的生物制品中，其成分较复杂且不易挥发，故本文参照有关实验^{[3, 4]}，运用内标法，采用顶空气相色谱法测定丝素生物制品中甲醇含量，建立了一种切实可行的检测丝素生物制品中残留甲醇的顶空气相色谱法。该法简单、方便、灵敏、可靠，完全适用于丝素生物制品中甲醇的检测。现报告如下。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

Varian3400气相色谱仪(美国Varianinc公司)；氢火焰离子化检测器(FID)，石英毛细柱（SE-30，50m×0.53mm×3.0m）；微量注射器（100～1000l）；电热恒温干燥箱，甲醇(色谱纯)，异丙醇(色谱纯)；电子天平（日本岛津公司）；丝素生物材料（自制）:将蚕丝先脱去丝胶，然后用CaCl2:乙醇:水三元溶液溶解后，用透析膜透析后，冷冻干燥，用80%的甲醇进行胶联，然后用蒸馏水清洗，于50℃下干燥。

1.2 气相色谱测定条件

柱温：50℃，保持2min，以10℃/min的速率升到160℃，保持5min；进样器温度：130℃；检测器温度：150℃；顶空汽化温度：80℃；顶空平衡时间：30min；气液体积比：4∶1。

1.3 内标液的配制

用微量注射器准确取0.25ml异丙醇（其密度为0.785g/ml），注入清洁10ml的容量瓶内，准确定容、摇匀后作为储备液；取0.1ml的储备液，注入清洁10ml的容量瓶内，准确定容、摇匀，浓度为19.63g/ml，作为内标溶液。

1.4 甲醇标准溶液对照液配制

用微量注射器准确取0.1ml的甲醇（已知甲醇的密度是0.792g/ml），注入清洁10ml的容量瓶内，准确定容、摇匀后作为储备液；各准确取0.10,0.15,0.20,0.25,0.30ml储备液注入清洁10ml的容量瓶内，准确定容、摇匀，得系列标准溶液。

1.5 样品制备

用电子天平取一定量样品置于10ml顶空瓶中，加入2.0ml蒸馏水，加0.1ml内标液，压盖密封后，放置过夜。

2 结果 2.1 内标物选择

选定异丙醇作为内标物，主要是因为：（1）在丝素生物制品中不含有异丙醇成分；（2）异丙醇保留时间与甲醇组分相近，但能完全分离；（3）其化学结构与甲醇组分相似；（4）不与甲醇组分发生任何化学反应。

2.2 标准液浓度确定

由于样品中甲醇的含量很少，经过多次实验后甲醇标准液的浓度分别选定为79.2,118.8,158.4,198.0,237.6g/ml。

2.3 内标用量选择

在其他实验条件不变的情况下，仅改变异丙醇的浓度，发现异丙醇的浓度为19.63g/ml时其峰面积与标准液的峰面积比例适宜，所以内标异丙醇的浓度定为19.63g/ml。

2.4 样品处理

样品配置好要过夜，使水充分浸泡丝素制品，在顶空汽化的过程甲醇会更加完全的进入到顶空气体中。平衡时间的选择:配置好的样品，在80℃的条件下放置10,20,30,40,50min，分别在相同的条件下测定，结果甲醇在10～30min时峰面积随时间增加而增大，30min后峰面积则基本不变，即30min后气液基本达到平衡，因此，选择平衡时间为30min。

2.5 标准曲线

取系列标准溶液各1.0ml到10ml洁净的顶空瓶中加入1.0ml蒸馏水和0.1ml内标液，压盖密封后按1.2所规定的色谱条件设定分析参数，待仪器稳定后分别抽取顶空气1.0ml注入色谱柱，以待测物质的浓度与内标浓度之比为横坐标，以待测物峰面积内标峰面积之比为纵坐标定量。线性关系良好，回归方程为:Y=8.18×10-2＋6.43×10-3X，相关系数r=0.9929。

2.6 回收率测定及相对标准偏差

分别称取一定量的丝素生物制品按上述样品测定方法测定样品中甲醇含量，每个样品平行测定6次，并计算相对标准偏差（RSD）。然后，在同样的样品溶液中准确加入一定量的甲醇标准溶液，按相同的分析步骤测定其中加入甲醇的量，分别进行3次平行测定，并计算回收率，回收率分别为99.12%，97.58%和105.61%。

3 小结

实验结果表明，本方法具有实用性，可用于丝素生物制品中残留甲醇的测定。与外标法比较，内标法具有准确度高，重复性好，不受进样误差对结果的影响等优点^[5]。该方法测定甲醇含量的相对标准偏差为2.4%～4.9%，回收率为97.58%～105.61%，具有简便、快速、灵敏度高、重现性好等特点。