中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (1): 83-84   PDF    
引用本文
任锐, 李百祥, 张晓峰. 氯化铝致原代培养大鼠海马神经细胞毒性作用[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(1): 83-84.
REN Rui, LI Bai-xiang, ZHANG Xiao-feng Efleets of aluminum chloride on primary cultured hippocampus neuron of rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(1): 83-84.
氯化铝致原代培养大鼠海马神经细胞毒性作用
任锐, 李百祥, 张晓峰     
哈尔滨医科大学公共卫生学院, 哈尔滨 150081
收稿日期: 2007-04-12
作者简介: 任锐(1975-), 女, 黑龙江哈尔滨人, 讲师, 博士, 主要从事神经毒理学研究工作。
摘要： 目的 研究铝对体外培养海马神经细胞的毒作用及神经毒性毒作用机制。 方法 分别用浓度为10, 100, 1000μmol/L的AlCl3对原代培养大鼠海马神经细胞染毒24和48 h, 检测AlCl3对海马神经细胞形态影响; 吖啶橙-溴化乙锭染色判断海马神经细胞存活率; Hoechst 33258染色判断海马神经细胞凋亡。 结果 AlCl3可造成海马神经细胞突起萎缩, 细胞胞体增大变圆、细胞数量减少, 并且细胞界限不清, 并随着AlCl3浓度增加和染毒时间延长而加重, 具有明显剂量-反应关系。AlCl3对海马神经元生长有明显的抑制作用, 与对照组比较, 呈现明显时间-剂量-反应关系(P < 0.05)。AlCl3可使海马神经细胞胞核明显固缩、凝集或断裂, 发生典型的凋亡改变, 随着染毒时间延长和A13+浓度增加, 凋亡发生率也明显增加。 结论 铝可对原代培养海马神经细胞产生细胞毒性, 可引起细胞结构改变, 抑制海马神经细胞生长, 并可诱导细胞凋亡。
关键词： 铝     海马     神经毒性     原代培养    
Efleets of aluminum chloride on primary cultured hippocampus neuron of rats
REN Rui, LI Bai-xiang, ZHANG Xiao-feng     
College of Public Health, Harbin Medical University Harbin 150081, China
Abstract: Objective To study the toxic effiect of aluminum on the primary cultured rathippocampus neuron and the mechanism of neurotoxicity of aluminum. Methods Hippocampus neurons were separated and cultured from newborn Wistar rats.The hippocampus neurons were cultured with AlCl3(10, 100, 1000 mol/L AlCl3 and control) for 24h and 48h.The mor phology of hippocampus neurons were observed by light microscopy.The method of acridine orange and ethidium bromide staining was applied to detect the viability of hippocampus neurons.Hoechst 33258 nucleus staining was used to observe the characters of apoptosis. Results AlCl3 can cause cell atrophy and cell body became round and swollen, and the number of neurons were decreased.AlCl3 decreased the viability of cultured hippocampus neurons significantly compared with control group (P < 0.05) in a time-dose-dependent manner.AlCl3 also can induce a significant apoptosis rate of the cultured hippo campus neurons compared with control group (P < 0.01) in a time-dose-dependent manner. Conclusion AlCl3 was toxic to the primary cultured hippocampus neurons of rat, and AlCl3 can inhibit the growth and develop hippocampus neurons.AlCl3 induced the apoptosis of hippocampus neurons.
Key words: Aluminum     neurotoxicity     hippocampus neurons     primary culture    

铝及其制品以其外观好、质轻、可机加工性、物理和力学性能好，以及抗腐蚀性好等优点而被广泛应用于日常生活、医药和工业等方面。随着人们与铝接触日益广泛，铝对人类健康影响受到关注。 研究表明，铝是一种神经毒物[1]，它可通过饮水、食品添加剂、药品等途径进入人体，长期接触可引起神经系统的慢性退行性病变，并且有报道铝蓄积与老年痴呆(Alzheimer)病有一定的相关性[2]。但是铝的神经毒作用机制尚无定论。为进一步探讨铝对学习记忆的关键部位-海马的神经毒作用机制，本研究通过体外实验方法探讨铝对海马神经细胞的毒性作用。

1 材料与方法 1.1 动物

新生1～3 d Wistar大鼠，雌雄不拘。

1.2 试剂

无水AlCl3(天津耀华公司)；胎牛血清培养基(DMEM)、B-27添加剂(美国Gibco公司)；马血清、胎牛血清(美国Hyclone公司)；神经生长因子β(nerve growth factor，NGF)、胰蛋白酶、谷氨酰胺、阿糖胞苷、肝素钠(HEPES)、Hoechst 33258荧光染料(美国Sigma公司)；L-多聚赖氨酸、烯醇化酶(NSE)兔多克隆抗体、免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)；二氨基联苯胺显色剂(DAB)(北京中山公司)；吖啶橙、溴化乙锭、考马斯亮蓝G-250(上海华舜公司)。接种培养液：DMEM 87％，胎牛血清10％，200mmol/L L-谷氨酰胺储备液1％，1万u/ml青链霉素储备液1％，1 g/ml β-NGF储备液1％；维持培养液：DMEM 75％，马血清10％，胎牛血清10％，200 mmol/L L-谷氨酰胺储备液1％，1万u/ml青链霉素储备液1％，1 g/ml β-NGF储备液1％，β-27.2％。

1.3 方法 1.3.1 培养方法

取新生1～3 d的Wistar大鼠，用75％乙醇消毒；在无菌条件下断头，取出全脑立即置于冰D-Hank's液中，去除小脑、延髓，剔除软脑膜和血管，分离出海马：将分离出的海马组织置于3～5倍体积的2.5 g/L胰蛋白酶中，37℃消化30 min；将胰蛋白酶丢弃，终止消化，800 r/min离心5 min，冲洗后组织吹打成细胞悬液，静置1～2 min后，重复上一过程；将上述细胞悬液混合后经200目不锈钢筛网过滤，用细胞计数板计数，调整细胞悬液细胞密度为5×105个/ml，将细胞悬液接种到内有盖玻片的35 mm培养皿中(培养皿事先用1 mg/ml多聚赖氨酸处理过)，每皿接种2 ml；37℃ 5％CO2孵箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃去接种培养液，改用维持培养液培养；每3d半量换液1次；培养的第3d在培养液中加入阿糖胞苷储备液(使其终浓度为5 mol/L)。

1.3.2 原代培养海马神经元的鉴定

应用免疫组化方法(SABC)检测神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase，NSE)抗体的表达情况。

1.3.3 AlCl3染毒

取培养8 d海马神经细胞，分别在培养液中加入AlCl3储备液，使其终浓度分别为10，100，1 000 mol/L，分别培养24和48 h，在倒置显微镜下观察细胞形态，并拍照；同时进行细胞存活率和凋亡检测。

1.3.4 AlCl3对原代培养海马神经细胞存活率的影响

将吖啶橙工作液(1 mg/ml)与溴化乙锭工作液(1 mg/ml)按照1∶1比例，加入培养细胞平皿中；在倒置荧光显微镜下，用波长为405 nm的激发光激发，观察计数活细胞与死细胞的比例；分别随机选取3个视野，每个视野计数100个细胞，按照公式计算细胞存活率。

 1.3.5 AlCl3对原代培养海马神经细胞凋亡的影响

将培养细胞用蒸馏水漂洗后，在培养皿中加入Hoechst 33258工作液(5 g/ml)2 ml，染色10 min；荧光显微镜下观察。如果见到细胞核呈现3个或3个以上荧光碎片，该细胞即为肯定的凋亡细胞。计算细胞中凋亡率，分别随机选取3个视野，每个视野计数100个细胞，计数凋亡细胞个数，计算凋亡率。

凋亡率=凋亡细胞/细胞总数×100%。

参考文献
[1] Becaria A, Campbell A, Bondy SC. Aluminum as a t oxicant[J]. Toxicol Ind Health, 2002, 18(7) : 309–320. DOI:10.1191/0748233702th157oa
[2] 颜世铭, 洪昭毅, 李增禧. 实用元素医学[M]. 郑州: 河南医科大学出版社, 1999: 337.
[3] 景玉宏, 冯慎远, 王飞. 铝对大鼠学习记忆的影响以及海马CA3区突触界面结构改变的实验研究[J]. 解剖学科学进展, 2001, 7(1) : 4–6.
[4] 杨俊, 贾宜昌, 赵人铮, 等. 铝染毒对大鼠海马中五种元素含量的影响[J]. 中华预防医学杂志, 2002, 36(4) : 247–249.