中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (1): 70-71   PDF    
引用本文
陈照立, 李海峰, 王景峰, 金敏, 谌志强, 王新为, 李君文. 二羟环氧苯并芘致肺癌相关基因筛选[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(1): 70-71.
CHEN Zhao-li, LI Hai-feng, WANG Jing-feng, et al. Screening of lung tumor susceptibility gene caused by benzo (a) pyrene dihydrodiol epoxide[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(1): 70-71.
二羟环氧苯并芘致肺癌相关基因筛选
陈照立, 李海峰, 王景峰, 金敏, 谌志强, 王新为, 李君文     
军事医学科学院卫生学环境医学研究所, 天津 300050
收稿日期: 2007-04-13
作者简介: 陈照立(1971-), 男, 山东曹县人, 博士在读, 研究方向.化学致癌物的分子机制;
李君文。
摘要： 目的 筛选与二羟环氧苯并芘, (BPDE)引发肺癌相关基因的DNA片段, 为进一步探讨BPDE致癌机制提供研究依据。 方法 应用扩增片段长度多态性(AFLP)结合免疫磁珠分离等技术对与BPDE相互作用的DNA片段进行富集、扩增, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示差异片段, 并对其回收、克隆、测序及同源相似性比对分析。 结果 成功回收了差异片段, 经测序得到其碱基序列, 基因同源相似性比对分析发现, 有8条序列与已知基因同源, 另有1条序列未找到同源序列, 将该序列向GenBank提交注册, GenBalak已接受并给予登录号为:EF176681。 结论 AFLP结合免疫磁珠分离等技术可以用于化学致癌BPDE肿瘤易感基因的筛选, 所得9条基因片段可能与BPDE引发肺癌有关。
关键词： 二羟环氧苯并芘     扩增片段长度多态性     纳米磁颗粒    
Screening of lung tumor susceptibility gene caused by benzo (a) pyrene dihydrodiol epoxide
CHEN Zhao-li, LI Hai-feng, WANG Jing-feng, et al     
Institute of Environment and Health, Academy of Military Medical Science Tianjin 300050, China
Abstract: Objective To screen tumor susceptibility gene of lung cancer induced by benzo[a]pyrene dihydrodiol epoxide (BPDE) interaction with mice lung DNA and settle a foundation for exploring carcinogenesis mechanism of BPDE. Methods Amplified fragment length polymorohism (AFL P) combination with immunomagnetic beads isolation were used to enrich and amplify fragments of BPDE interaction with DNA.Differential fragments were displayed by polyacrylamide gel electrophoresis and silver nitrate staining.The differential fragments were sequenced and compared with known genes in genbank. Results 9 differential bands were successfully collectad, cloned and sequenced, and one fragment could not be found in the known genes, and then was submitted to genbank (accession number:EF 176681). Conclusion AFLP combination with immunomagnetic beads isolation technique can be used to screen tumor susceptibility gene of chemaicl carcinogens BPDE, the 9 sequences may be relevant to lung cancer induced by BPDE.
Key words: benzo[a]pyrene dihydrodiol epoxide (BPDE)     amplified fragment length polymorphism (AFLP)     immunomagnetic beads isolation    

苯并［a］芘是一种前致癌物，需在体内代谢生成活性代谢物二羟环氧苯并芘(benzo［a］pyrene dihydrodlol epoxide，BPDE)才具有强致癌性。BPDE，是终致癌物，具有亲电子性，可以与DNA的亲核位点鸟嘌呤的外环胺基端共价结合，形成BPDE-DNA加合物，引起DNA碱基突变，细胞恶性转化，发生肿瘤[1]。但其致癌机制尚不十分清楚，仅少数已知基因对探讨BPDE致癌机别远远不够，有必要发现更多的BPDE致癌相关基因。本文利用免疫纳米磁珠法从扩增片段长度多态性(AFLP)片段中富集、分离与BPDE相互作用的DNA片段，并对其进行克隆、测序及同源相似性比对分析，以筛选与BPDE发肺癌相关的已知基因或/和未知基因。

1 材料与方法 1.1 材料

BALB/c小鼠(军事医学科学院实验动物中心)；二羟环氧苯并芘(美国国家癌症研究所化学致癌物标准物质贮藏室)；四氢呋喃(美国Sigma公司)；纳米磁颗粒(本实验室自制)；BPDE单克隆抗体clone 8E11(荷兰Hycult公司)；TaqI/Pst I(美国Invitrogen公司)；接头和引物由大连宝生物公司合成。

1.2 基因组DNA的提取

小鼠肺组织基因组DNA的提取按试剂盒(北京天根公司)说明书进行。

1.3 AFLP-DNA片段的获得及BPDE-DNA加合物形成

基因组DNA经Taq I/Pst I双酶切获得AFLP-DNA片段，向免疫纳米磁颗粒特异分离组的酶切产物中加入BPDE四氢呋喃溶液，37℃孵育1周，形成BPDE-DNA加合物，其余组加入等量的超纯水代替BPDE四氢呋哺溶液。

1.4 免疫纳米磁颗粒分离BPDE-DNA加合物

将裸纳米磁颗粒与BPDE单克隆抗体在4℃避光孵育过夜，耦联形成免疫纳米磁颗粒。再加入至含有BPDE-DNA加合物的溶液中，室温轻摇20min，磁场作用5min，弃上清，水洗2次，加适量水重悬磁颗粒-Ab-BPDE-DNA复合体，于95℃加热10min，11000r/min离心5min，收集上清液，即含有与BPDE相互作用的AFLP-DNA片段。

1.5 DNA片段的连接、预扩增和选择性扩增

把获得的DNA片段参照文献[2]进行DNA片段的连接、预扩增和选择性扩增。

1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色

制备含7 mol/L尿素的6%变性聚丙烯酰胺凝胶，加样，以60W恒功率电泳150min，凝胶经10％冰乙酸固定20min，水洗3次，每次3min。再至硝酸银染液中染色40min，短暂水洗5～10s，立即放入4℃预冷的显色液中显色，直至出现清晰模板条带，加入固定液终止显色，水洗2次，每次2min，室温下晾干观察。

1.7 差异片段的回收、扩增

将差异片段用锋利刀片从银染胶上准确地切下，转至0.2ml离心管中，加水30～40l，100℃煮沸10min，10000r/min离心10min，吸取上清-20℃冻存备用。取7l回收上清进行PCR再扩增，引物与选择性扩增相同。

1.8 回收扩增产物的克隆测序及序列的同源相似性比对分析

对回收扩增产物进行克隆、测序，所得核酸序列进行同源相似性比对分析，从而获得与BPDE相互作用的已知基因和/或未知基因。

2 结果 2.1 AFLP差异条带图谱

选择性扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，可得到清晰的黑灰色电泳条带图谱，并可见免疫纳米磁颗粒特异分离组与免疫纳米磁颗粒非特异吸附组和裸纳米磁颗粒非特异吸附组之间有差异条带出现(图 1)。

注：M：pBR322DNA/Msp Imarker；1：正常对照组；2：裸纳米磁颗粒非特异吸附组；3：免疫纳米磁颗粒非特异吸附组；4～7：免疫纳米磁颗粒特异分离组。箭头所示为免疫纳米磁颗粒特异分离组与裸纳米磁颗粒非特异吸附组和免疫纳米磁颗粒非特异吸附组之间的差异条带。 图 1 AFLP聚丙烯酰胺凝胶电泳条带图谱

2.2 差异DNA片段的回收

回收的差异条带上清液经PCR再扩增，得到与原条带大小一致的条带，回收及PCR再扩增获得了成功(图 2)。

注：M：DL2000；其余泳道为不同差异条带的回收再扩增产物。 图 2 回收条带PCR再扩增产物琼脂糖电泳

2.3 差异DNA片段的测序及同源相似性比对分析

与已知基因同源比对，获得已知基因8条，另有l条序列未找到同源序列，将该序列向GenBank提交注册，GenBank已接受并给予登录号为：EF176681，其核苷酸组成如下：GACGGCCGTCATGCAGACTCTGACTTTATAATGCTAATTAGTACTTGGTAGGTAACTTTCTAGTTGAATTTTAAGTAGGGCGTTGGAACTCTGGCTAAGTTTGACTGAACAATGTGAAAATAACACTAAGTTGATATTCCTCCGCATTTTTGGATGATAGGTGGGAAACAGGGAGAAGGCGTTCGCTCAGGACTCATC。

3 讨论

BPDE与DNA共价结合形成加合物后，可以引起DNA碱基发生点突变，但突变的特异性与加合物位点的碱基序列和局部构象有关[3]。p53，ras，c-myc等基因的突变均与BPDE引发肿瘤有关[4-6]，说明BPDE可能通过多种基因作用而引发肿瘤。BPDE致癌途径、作用点是复杂、多位点的。然而，若要筛选出与BPDE致癌相关的特异或易感基因，首先必须获得与BPDE相互作用的DNA片断。AFLP技术已广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性研究、基因定位及品质鉴定等方面[2, 7]，适用于肿瘤易感基因的筛选[8]。

本实验应用AFLP并结合免疫磁珠分离等技术，成功对与BPDE相互作用的DNA片断进行了富集和扩增，并对差异条带进行回收。由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上样量受限，回收产物的量极少，在上样时对免疫纳米磁颗粒特异分离组每个样品上样3个泳道，以增加回收产物的量，然后进行PCR进一步扩增，使差异片段DNA的量大大增加。经测序和同源相似性比对分析发现，有8条序列与已知基因具有同源性，主要为信号转导及通路、生长发育、血管生成、免疫及炎性反应、细胞分化、转录调控等方面的基因，提示BPDE有可能是通过多基因、多途径来发挥其致癌作用的，与文献报道一致[9]。有1条序列未找到同源序列，已在GenBank注册登记，并给予序列登录号EF176681，有可能是1个新的未知基因，但目前尚不能确定这条序列的应用价值，有待进一步研究。

参考文献
[1] Li D, Firozi P E, Wang L E, et al. Sensitivity to DNA damage in-duced by benzo (a) pyrene diolepoxide and risk of lung cancer :a case -control analysis[J]. Cancer Research, 2001, 6(4) : 1445–1450.
[2] Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. AFLP : a new technique for DNAfingerprinting[J]. Nucleic Acids Research, 1995, 23(21) : 4407–4414. DOI:10.1093/nar/23.21.4407
[3] Jernstrom B, Graslund A. Covalent binding of benzo[J]. Biophysical Chem-istry, 1994, 49(3) : 185–199. DOI:10.1016/0301-4622(93)E0087-L
[4] Bitton A, Neuman M, D, Barnova J, et al. The p53 tumour suppres-sor gene and the tobacco industry : research, debate, and conflict of interest[J]. Lancet, 2005, 365(9 -58) : 531–540.
[5] Hu W, Feng Z, Tang M S. Preferential carcinogen -DNA adduct/formation at codons 12 and 14 in the human K-ras gene and their possible mechanisms[J]. Biochemistry, 2003, 42(33) : 10012–10023. DOI:10.1021/bi034631s
[6] Fields W R. Desiderio J G, Leonard R M, et al. Differendtial c -myc expression profiles in normal human bronchial epithelial cells following treatment with benzo[ a ]pyrene, benzo[ a ]pyrene -4, 5 e-poxide, and benzo[ a ]pyrene -7, 8 -9, 10 diol epoxide[J]. Molecu-lar Carcinogenesis, 2004, 40(2) : 79–89. DOI:10.1002/(ISSN)1098-2744
[7] 宾晓农, 谭敏, 吕嘉春, 等. 基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因[J]. 中国公共卫生, 2006, 22(11) : 1350–1352.
[8] Valverde A, Okon Y, Burdman S. cDNA -AFLP reveals differen-tially expressed genes related to cell aggregation of Azospirillum brasilense[J]. FEMS Microbiol Lett, 2006, 265(2) : 186–194. DOI:10.1111/fml.2006.265.issue-2
[9] 梁智勇, 史景泉, 魏泓, 等. 应用AFLP法检测小鼠高低转移性肝癌细胞株基因组的遗传差异[J]. 第三军医大学学报, 2002, 24(12) : 1416–1419.