内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是目前己知作用最强、最持久的内源性缩血管活性多肽，它与内皮素A型受体(endothelin A receptor，ETAR)结合产生极强的收缩血管和支气管作用^[1]。生理状态下，ET-1通过收缩血管、调节肾小管分泌排泄和肾小球超滤过系数(Kf)，与其他肾脏调节因素一起维持肾功能。这种调节机制一旦紊乱，ET-1便作为一种致病因子引发或参与肾脏病理生理过程^[2]。芥子气中毒可造成包括肾脏在内的多器官损伤，且肾脏芥子气含量较高。本文旨在探讨ET-1和ETAR在芥子气中毒引起肾功能损伤中的作用。

雄性SD大鼠，体质量200～300g(中国科学院上海实验动物中心)；芥子气(第二军医大学海医系防化医学教研室)；S-P试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)；内皮素抗体(美国Oncogene公司)；柱离心式组织总RNA抽提试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)；逆转录试剂盒(上海申能******公司)；随机引物Oligo(dT)18(上海生工生物工程公司)；特异引物依据文献^[3]序列，由上海生工生物工程公司合成，preproET-1(正义链)：5'-TCTTCTCTCTGCTGTTTGTG-3'，preproET-1(反义链)：5'-TAGTTTTCTTCCCTCCACC-3'，扩增产物大小为482 bp；ETAR(正义链)：5'-ATCGCTGACAATGCTGAGAG-3'，ETAR(反义链)：5'-CCACGATGAAAATGGTACAG-3'，扩增产物大小为226 bp；GAPDH(正义链)：5'-GCCATCAACGACCCCTTCATTG-3'，GAPDH(反义链)：5'-TGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3'，扩增产物大小为592 bp。

大鼠随机分为正常组和中毒组，中毒组分中毒后2，6，12，24h 4个时相点(n=10)。芥子气纯度用冰点法测定为97％，相对密度1.27，临用前丙二醇稀释成0.2%(w/v)溶液，中毒组背部皮下注射芥予气［5mg/(kgbw) )半数致死量(LD50)］，对照组注射等量丙二醇。

断头处死大鼠，摘取肾脏，甲醛固定，制作石蜡切片，苏木素-伊红(H-E)染色，观察肾脏光镜下病变；并用链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化染色法(S-P方法)进行免疫组化染色，操作按试剂盒说明书，结合图像分析肾组织ET-1含量。从每张肾脏免疫组化切片随机选取5个视野，用Smart Scape 2002图像分析系统测量其平均吸光度(A)值(积分值)，以此表示肾组织ET-l含量。

采用柱离心式组织总RNA抽提试剂盒提取总RNA，用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，要求所用RNA的A260/A280在1.8～2.0之间。采用RT-PCR法测定前原内皮素(preproET-1)、ETAR及3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的mRNA表达。取2g总RNA采用逆转录试剂盒，以Oligo(dT)18为引物合成cDNA，反应总体积为20l。PCR反应采用PCR扩增反应试剂盒，扩增反应引物为合成的特异引物，取每份标本的逆转录产物3l分别进行GAPDH、preproET-1、ETAR的cDNA扩增，扩增条件参照文献^[3]。进行94℃ 15s，退火15s，72℃45s的热循环，GAPDH退火温度为62℃，32个热循环；prepro ET-1退火温度为54℃，38个热循环；ETAR退火温度为58℃，35个热循坏。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后拍照，然后进行吸光度扫描，并以GAPDH校正作相对量分析，数据以吸光度的比值表示。

采用SPSS 12.0软件进行统计分析，组间比较采用方差分析。

光镜下观察，大鼠芥子气中毒后肾血管充血、水肿，肾实质细胞水样变性，肾小管上皮细胞变性坏死、脱落，基底膜裸露。远曲小管上皮ET-1呈阳性反应，上皮细胞胞浆内可见多量密集分布的深棕色颗粒，而近曲小管和集合管上皮细胞胞浆呈阴性反应。用图像分析系统测量结果表明，对照组吸光度值为273±78；中毒组染毒2h后吸光度值升至341±86，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明肾组织ET-1浓度明显升高；6h后达峰值，吸光度值为719±128；24h后虽有所回落，吸光度值降至378±88，但与对照组比较差异仍有统计学意义(P<0.01)。

图 1

注：a：对照组；b：染毒后2h；c：染毒后6h；d：染毒后12h；e：染毒后24h。 图 1 免疫组化分析肾脏ET-1含量的变化(HE染色，×400)

中毒后肾脏preproET-1、ETAR基因的表达明显增加。凝胶电泳结果表明，preproET-1 mRNA表达值对照组为0.15±0.02；染毒6h为0.37±0.05，是对照组的2倍多，达峰值；24h后降至0.25±0.03，但与对照组比较差异仍有统计学意义(P<0.01)。ETAR mRNA表达值对照组为0.50±0.03；染毒6h上升达峰值，为0.79±0.10，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；24h后恢复至0.52±0.04，与对照组水平相近。

图 2

注：a对照组；b：染毒后2h；c染毒后6h；d.染毒后12h；e：染毒后24h。 图 2 肾脏preproET-1 mRNA及ETAR mRNA表达变化

肾脏不仅是ET-1合成和分泌的重要场所，也是ET-1作用的靶器官，肾脏血管对ET-1的敏感性比支气管、冠状动脉等组织高出10倍。ET-1以自分泌或旁分泌方式调节肾脏功能，肾脏ET-1表达和释放异常是肾脏疾病发生发展的原因之一^[4-6]。例如，缺血、缺氧和酸中毒等可促进肾内ET-1及其受体基因表达，ET-1合成释放增加^{[7, 8]}。

本研究结果表明，大鼠芥子气中毒后肾脏出现明显的病理学改变，远曲小管ET-1含量显著升高。中毒后肾组织中ET-1增加，主要是由于ET-1 mRNA的转录增加所致。大鼠芥子气中毒后肾脏preproET-1基因的表达明显增加，在6h为对照组的2倍多，达峰值，与远曲小管ET-1浓度的变化相对应。ET-1只能通过与细胞膜上特异受体ETAR结合而发挥效应，芥子气中毒后ETAR mRNA的表达也显著增加。肾组织中高表达的ET-1 mRNA、ETAR mRNA使ET-1大量分泌，同时使ETAR表达上调。提示芥子气中毒后，ET-1与ETAR大量结合，产生收缩效应，导致肾血管强烈而持久地收缩，肾循环血流量减少，肾脏灌注不良，进一步导致系膜细胞收缩，肾小球超滤过系数下降，进而使肾小球滤过系数下降，损害肾功能。