2007, Vol. 23
锰中毒已成为世界性关注的公共卫生问题。随着汽车数量增加，尾气排放增加，造成环境中锰含量增高[1, 2]。目前环境因素对男性生精功能的影响越来越为人们所重视[3, 4]。生精细胞凋亡由多种因素诱导和调节，这些因素调控失调可能是导致生精障碍的一个重要原因[5]。为此，研究谷光甘肽(GSH)对染锰大鼠生精细胞凋亡与p53和Bcl-2表达的影响及作用机制，为锰生殖毒性的预防、早期诊断和治疗提供实验数据。
1 材料与方法 1.1 实验动物雄性SD大鼠48只，体重150～180 g。合格证号：SCXK(渝)20020003。随机分为6组，分别为空白对照组、GSH对照组、15，30 mg/kg组，15 mg/kg+GSH组，30 mg/kg+GSH组，每组8只。空白对照组和GSH对照组分别给予生理盐水4周，再分别给予生理盐水和GSH(1 mmol/kg)2周15和30 mg/kg组分别给予氯化锰(MnCl24H2O)15，30mg/kg 4周，然后给予生理盐水2周；15 mg/kg+GSH组、30 mg/kg+GSH组分别给予氯化锰15和30 mg/kg 4周,然后给予GSH 1 mmol/kg 2周[6, 7]。给药途径均为腹腔注射，每周5 d，1次/d。于第6周全部处死。
1.2 主要试剂和仪器MnCl24H2O(中国医药集团上海化学试剂公司)；GSH分析纯(美国Sigma公司)；原位凋亡检测测试盒(德国Boehringer Mannheim)；Bcl-2兔抗多克隆抗体、p53兔抗多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。
1.3 标本收集于第6周末大鼠全部行乙醚麻醉，迅速剖腹取出双侧睾丸置于-70℃速冻。
1.4 缺口末端标记法(TUNEL)检测生精细胞凋亡取出冷冻右侧睾丸标本，冰冻切片机冠状位切片，片厚7～8 μm，所有载玻片均经多聚赖氨酸浸泡防脱片处理。按试剂盒说明书进行。
1.5 免疫组化法(S-P)检测Bcl-2和P53表达取出冷冻右侧睾丸标本置入10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，冠状位连续切片，片厚4 μm，60℃烤片2 h备用。检测Bcl-2和p53表达。
1.6 光镜下观察结果每张切片在冠状位的近长轴上，从左至右连续观察10个生精小管。凋亡细胞的细胞核呈棕黄色或棕褐色，计数TUNEL阳性生精细胞数和总生精细胞数，计算出阳性细胞百分率即生精细胞凋亡指数(AI)。生精细胞p53表达阳性的细胞核均被染成棕黄色或棕褐色、Bcl-2表达阳性的细胞质呈棕黄色。分别计数、p53及Bcl-2表达阳性的生精细胞数占总生精细胞数的比例，即为生精细胞p53阳性细胞百分率和Bd-2阳性细胞百分率。
1.7 统计分析采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，组间比较采用t检验，两变量间的关系采用直线相关分析。检验水准α=0.05，P<0.05差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 睾丸生精细胞凋亡指数凋亡细胞见于精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子，凋亡细胞的细胞核呈棕黄色。15和30 mg/kg MnCl2可诱导大鼠生精细胞凋亡。1 mmol/kg GSH对15 mg/kg MnCl2诱导大鼠生精细胞凋亡具有一定的拮抗作用(表 1，图 1，2，3)。
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表 1 大鼠睾丸生精细胞AI、P53及Bcl-2阳性细胞率(x±s,%) |
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图 1 GHS 对照组大鼠睾丸生精细胞凋亡( TUNEL×400) |
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图 2 15 mg/ kg MnCl2 组大鼠睾丸生精细胞凋亡( TUMEL×400) |
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图 3 15 mg/ kg MnCl2+ GHS 组大鼠睾丸生精细胞凋亡 (T UMEL×400) |
2.2 睾丸P53表达
免疫组化染色显示，p53免疫阳性产物位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色。主要表达于精原细胞和精母细胞。p53阳性细胞率与染锰剂量存在明显的剂量-效应关系。1 mmol/kg GSH对大鼠生精细胞p53表达具有一定的抑制作用。直线相关分析发现各组大鼠睾丸生精细胞AI与p53阳性细胞率呈显著相关(r=0.91，P<0.01)(表 1，图 4)。
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图 4 30 mg/ kgMnCl2+ GSH 组大鼠睾丸生精细胞P53 的表达( S-P×400) |
2.3 睾丸Bcl-2表达
免疫组化染色显示，Bcl-2蛋白的阳性产物主要表达在精子细胞和精母细胞的细胞质，呈棕黄色。30 mg/kg组的阳性细胞率较其余各组显著降低，而其余各组间差异无统计学意义。(表 1，图 5，图 6)。
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图 5 空白对照组大鼠睾丸生精细胞Bc-l 2 的表达( S-P×400) |
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图 6 30 mg/ kg 组大鼠睾丸生精细胞Bc-l 2 的表达( S-P×400) |
3 讨 论
正常情况下，生精细胞的分裂、增殖、分化与凋亡维持着一种动态平衡，本实验发现，锰能引起生精细胞凋亡增加，锰除诱发精原细胞和精母胞细凋亡增加外，精子凋亡增加也很明显，这可能是锰导致精子数量减少或无精子的主要原因。
细胞凋亡是受基因调控而实现的。本实验结果显示，各染锰组睾丸p53阳性表达增加，且阳性细胞率随染锰剂量的增加而增加。直线相关分析发现，生精细胞AI与p53阳性细胞率呈显著正相关，说明p53参与生精细胞凋亡的正向调节。
Yamamoto等[8]发现，Bcl-2在热诱导的生精细胞凋亡中作为Caspase的底物被分解而失去抗凋亡的活性。Voehringer等[9]发现，Bcl-2能促进GSH进入核内，改变核内氧化还原状态，阻断Caspase激活从而抑制凋亡。本实验结果显示，Bcl-2阳性表达在30 mg/kg组显著降低，其余各组间差异无统计学意义，这可能是GSH所起的作用。
梁刚[10]等研究GSH对氟所致大鼠脂质过氧化的影响时发现口服谷胱甘肽可提高睾丸SOD的活性。本实验结果显示，15 mg/kg染锰后予1 mmnol/kg GSH，睾丸生精细胞AI恢复正常，表明GSH降低锰诱发的生精细胞AI，可能是GSH使抗氧化酶清除自由基的能力增加，在一定程度上阻止活性氧ROS)诱导的生精细胞凋亡；另一方面GSH可能通过降低p53蛋白表达及提高Bcl-2蛋白表达水平来抑制锰诱发的生精细胞凋亡。本实验表明1 mmol/kg GSH对15 mg/kg染锰所致生精细胞凋亡具有一定的拮抗作用，但GSH的拮抗作用有限，30 mg/kg染锰后给予1 mmol/kg GSH，未使生精细胞AI恢复正常，仍引起了睾丸组织不可逆性损伤，这可能是染锰量偏高或投放GSH剂量偏小、时间不足所致，还需进一步探讨。
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