二甲硝咪唑(DMZ)对家禽黑头病的治疗有特效，然而其潜在的致癌性，使其成为在食源性动物中明令禁用和重点监控的兽药品种。目前，在黑头病的治疗方面尚未找到更好的替代药，违禁使用的案例时有发生。由于DMZ代谢极快，停药２ d后组织中已无法检测到残留，但鸡蛋却不同^[1]。RM Aerts^[2]报道，鸡经口染毒75 mg DMZ，1 d后在蛋中可检测到药物，且残留物持续长达8 d以上。为此，我们利用高效液相色谱－串联质谱联用法(LC-MS/MS)特有的选择性和高灵敏度，建立了LC-MS/MS测定鸡蛋中DMZ及其代谢标志物2-羟甲基-1-甲基-5硝基咪唑(DMZOH)^[3]的确证方法，样品处理简单，以内标法定量,方法准确可靠，能满足低浓度样品的定性、定量要求，适合违禁兽药滥用的监控。

Agilent 1100 液相色谱仪(美国Agilent公司)；API 3000串联三级四极杆质谱仪(美国应用生物系统公司)；Allegra 64R 高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；T-25匀浆机(德国IKA公司)；超声波发生器；旋涡混合器；氮气吹扫仪；0.45 μm水系针筒式微孔滤膜过滤器。

DMZ纯度>99.0%，(德国 Sigma-Aldrich公司)；DMZOH纯度>99.0%，(德国Merck公司)；氘代内标为d3-DMZ(德国 WTTEGA Laboratorien公司)，分别用甲醇配制成1 mg/ml的储备液；混合标准中间液：分别吸取适量DMZ和DMZOH储备液于容量瓶中，用甲醇稀释成1 μg/ml；内标中间液：吸取适量d3-DMZ储备液于容量瓶中，用甲醇稀释成1 μg/ml。所有标准避光保存于4℃冰箱中。甲醇、乙酸乙酯为色谱纯(Merck)；甲酸等均为分析纯；实验用水为二次蒸馏超纯水。

流动相：甲醇(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸水(40+60，v/v)；色谱柱：Atlantis C₁₈，5 μm，2.1 mm×150 mm；柱温：30℃；流速：0.20 ml/min；进样20 μl。

离子源为阳离子电喷雾电离模式(ESI+)，检测方式为多反应监测(MRM)方式，喷雾电压5500 V；离子源温度450℃；雾化气压力11 psi；气帘气压力8 psi；辅助气70 L/min；聚焦电压与入口电压分别为300 V、10 V。MRM参数见表 1。

表 1

表 1 多反应监测的MRM参数

表 1 多反应监测的MRM参数

准确称取(5.0±0.01)g已去壳均浆的鸡蛋样品，置于50 ml离心管中，添入20 μl混合内标标准溶液(浓度为1 μg/ml)，混匀，放置15 min，加入10 ml乙酸乙酯溶剂，超声5 min，4 000 r/min离心15 min，上清液转入试管中，下层残渣加人10 ml乙酸乙酯，重复提取１次，合并上清液,45℃氮吹至近干。加入1 ml正己烷和1 ml 0.1%甲酸震摇溶解残渣，再2 000 r/min离心10 min，弃去正己烷层，将余下的甲酸萃取液过0.45 μm微孔滤膜，滤液供Lc-MS/MS测定。

由于DMZ为碱性兽药，采用ESI＋电离模式效果好。利用针泵直接进样，观察DMZ、DMZOH母离子［M+H］⁺，然后分别找出其对应的信号较强的2～3个子离子，组成母离子与子离子监测离子对。而其他离子对则作为定性辅助离子对。液相色谱分离条件选择时，分别检验了乙腈和甲醇，甲醇的背景信号值更低，更适合于分析。由于ESI+模式下，流动相中加入甲酸可提高DMZ和DMZOH的离子化效率，实验选用在水相与有机相中均加入0.1%甲酸，MRM监测不需要色谱的完全分离，实验选择甲醇(含0.1%甲酸)－0.1%甲酸水(40+60，v/v)等度洗脱，以减少柱子的平衡时间，保留时间分别在3.7 min，3.0 min。

按欧盟2002/675/EC指令规定的要求^[4]，本实验采用串联质谱法监测MRM5个离子对，DMZ与DMZOH均具有1个母离子及2个子离子，完全满足上述要求。对可疑阳性样品，依据(１)保留时间；(２)定性离子对与定量离子对的相对丰度比进行判断。要求样品的保留时间与标准的平均保留时间之相对偏差在±2%以内；样品的2个离子对的相对丰度比值与标准的离子对的丰度比值之偏差不超过±20%。

样品依照本法处理后，Lc-MS/MS测定，采用内标标准曲线法定量，结果按下式计算：；Cx样品中DMZ或DMZOH浓度，μg/kg；Cs：标准曲线中得到的DMZ或DMZOH浓度，μg/L；W：样品重量g。如果样品浓度超过线性范围的上线浓度50 μg/L，则应适当稀释至线性范围内重新测定。

1 鸡蛋样品中加标MRM色谱图

分别准确吸取0，10，50，100，200，500 μL混合标准中间液(1 μg/ml)，置于6个10 ml容量瓶中，加入1 μg/ml内标中间液20 μl，用0.1%甲酸水溶液定容至刻度，配制标准工作系列。采用内标法定量，以标准峰面积与d3-DMZ内标峰面积比值为纵坐标，以标准浓度为横坐标绘制标准曲线，DMZ、DMZOH的线性回归曲线分别为：Y＝0.16X＋0.00875，r=0.9989；Y＝0.0517X＋0.0679，r=0.9996，相关系数r>0.998，显示线性良好。线性范围DMZ为0.03～50 μg/L；DMZOH为0.11～50 μg/L。

实验通过向空白鸡蛋样品中分别添加3个浓度水平1，4和10 μg/kg的标准，每一个添加水平包括6个重复样品，提取和测定按实验方法。结果显示，DMZ的回收率为90.4%～98.5%，变异系数CV＜4.4%；DMZOH的回收率为85.2%～102.5%，CV＜5.6%，表明方法的准确度和精密度良好。

对鸡蛋加标样品进行检测，DMZ浓度为0.25 μg/kg，DMZOH浓度为1 μg/kg，定量检测离子对的信噪比(S/N)检出限(LOD)按信噪比3:1计算，得到DMZ、DMZOH的LOD分别为0.009，0.034 μg/kg。定量限(LOQ)信噪比按10：1计算，得到其对应的LOQ分别为0.03,0.11 μg/kg，方法灵敏度衡高，可满足极低含量的药物残留检测需求。

图 2

图 2 DMZ 与DMZOH 定量检测离子对的信噪比(S/N)

本法采取乙酸乙酯提取样品、正己烷脱脂、0.1%甲酸水溶液溶解效果好，回收率高，DMZ、DMZOH回收率达到90.4%～98.5%与85.2%～102.5%,与乙腈提取液比较，有显著提高。文献报道^[5]，鸡蛋中DMZOH的回收率为62.2%～86.7%，DMZ为73.6%～81.2%，而且乙酸乙酯挥发性好，容易挥干，可以大大节省有机溶剂挥干时间。

在样品的处理方面，与Mortierl^[6]和Mortier P^[7]的研究方法比较，省去了固相萃取净化步骤。用正己烷萃取可以除去非极性脂肪，降低基质对残留物的测定影响，方法不仅简单、快捷，同时节约了成本。

以鸡蛋作为分析样本，避免了因药物代谢速度过快在鸡肉中无法检测的问题。利用串联质谱法MRM测量的选择性，建立了Lc-MS/MS测定鸡蛋中DMZ及其代谢标志物DMZOH的方法，方法灵敏度高，检出限可低至0.009与0.03 μg/kg，以内标法定量,准确可靠，能满足禁用物质定性、定量要求。为有效保障食品安全，开展药物调查溯源和卫生监督提供科学依据。