包膜病毒进入宿主细胞主要依靠其包膜胆固醇等脂类与宿主细胞胞浆膜等融合，而包膜糖蛋白则在病毒吸附、进入细胞及在细胞间扩散等过程中发挥一定的作用。人类疱疹病毒(HHV)包膜糖蛋白gQ和gL在其进入宿主细胞及在细胞间扩散时所发生的包膜融合中发挥作用^{[1, 2]}。提示包膜胆固醇水平可能与包膜病毒感染性有关。甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin,MβCD）是胆固醇结合剂，可以去除生物膜中的胆固醇^[3]。为了了解人类疱疹病毒-6（HHV-6）在去除包膜胆固醇后，病毒感染力暨包膜糖蛋白表达水平的变化，为进一步研究抗包膜病毒药物提供科学依据，本文采用甲基-β-环糊精去除HHV-6A包膜胆固醇，观察去除效果以及胆固醇缺失状态下病毒包膜糖蛋白表达水平。结果报告如下。

（1）病毒株与细胞株： HHV-6A GS株；易感T细胞株HSB-2；脐带血单核细胞（CBMCs）；均由大阪大学医学部微生物室惠赠。（2）试剂：含10％胎牛血清（FCS）的RPMI 1640细胞培养液（自行配置）；病毒包膜糖蛋白单克隆抗体(gO,gL,gQ等，日本大阪大学微生物室提供)；甲基-β-环糊精，免疫印迹实验（WB）试剂（日本TaKaRa公司）。（3）仪器设备：OptimaTM TLX超速离心机（美国BECKMAN公司）；荧光显微镜（日本NIKON ECLIPSE E600公司）；X光片曝光成像系统（日本富士公司）；CO₂培养箱（日本SANYO公司）。

（1）将HHV-6A GS感染生长良好的CBMCs，采用免疫荧光实验（IFA）检测，当感染细胞>80%时，2 500 r/min离心15 min，上清为游离病毒；取1 ml上清悬浮于2×106HSB-2细胞,共悬浮2×10⁷HSB-2细胞，每培养瓶（容量为200ml）为5×10⁶细胞，分别加入30ml的含10％FCS RPMI1640培养液，37℃培养。感染后72～96 h，4℃ 2 500 r/min离心15 min，上清加入20%蔗糖溶液，经4℃ 70 000 r/min离心2 h后，从管底收获病毒体并用0.22 m滤器过滤。用收获的病毒体再感染HSB-2细胞72 h，收获感染细胞，倒置显微镜下观察细胞变化，与正常未感染细胞对照。（2）纯化病毒：收集感染的HSB-2细胞上清液，用含有NaCl的10%聚乙二醇（分子量为20 kDa）沉淀病毒，重悬病毒后经15%～60%浓度梯度的蔗糖溶液70 000 r/min离心1 h，从梯度带中收集病毒后再70 000 r/min离心2 h沉淀浓缩病毒，用含10%FCS的RPMI1640液重悬沉淀并用0.22m的滤器过滤，收获HHV-6A纯化病毒备用。

（1）去除胆固醇：取纯化的HHV-6A，分别与PBS及0，1，2，3 mol/L各浓度的MβCD混合，37℃培养1 h后，用20%蔗糖溶液70 000 r/min 离心2 h，去除MβCD，收获去除包膜胆固醇的HHV-6A，用500l 含10% FCS的RPMI 1640液重悬病毒并用0.22m的滤器过滤备用。（2）胆固醇含量测定：HHV-6A分别与0，1，2，3,5,10 mmol/L各浓度的MβCD混合，37℃培养30 min，用20%蔗糖溶液70 000 r/min 离心2 h，去除MβCD，用胆固醇含量检测试剂盒(Molecular Probes)测定含量，按说明书操作；比较不同浓度MβCD作用下包膜胆固醇含量变化。

将HHV-6A GS与HSB-2细胞混合，按加入和不加入10 mmol/L MβCD进行处理，37℃培养30 min，用20%蔗糖溶液70 000 r/min 离心2 h，去除MβCD，加入上样缓冲液（含和不含2-巯基乙醇）处理后，分别采用15%，7%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后用抗-gQ1 或抗-gL单克隆抗体进行免疫杂交实验，检测病毒糖蛋白的表达水平。

HHV-6A GS感染HSB-2细胞72 h后，倒置显微镜下观察可见，细胞胞体变大，变圆，部分细胞出现融合等致细胞病变现象（图 1a）,与正常细胞（图 1b）比较变化明显。图 1 HHV-6A GS 感染HSB-2细胞后的变化

图 1

图 1 HHV- 6A GS 感染HSB-2 细胞后的变化

图 2可见，不同浓度MβCD对HHV-6A GS 37℃下作用1 h后，包膜胆固醇含量MβCD的浓度呈负相关。

图 2

图 2 不同浓度MBCD 对HHV-6A 包膜胆固醇含量影响

图 3可见，经MβCD处理和未经MβCD处理的HHV-6A糖蛋白gQ1和gL的表达均处在同一水平（图 3a）。而且上述2种样品中，均检测到靠二硫键连接形成的gH-gL复合体（图 3b ）。表明即使病毒包膜胆固醇被去除，包膜糖蛋白的表达并不受影响。

图 3

注: a1 抗-gL 和抗-gQ1 单克隆抗体检测还原状态的gL 和gQ11: MBCD 处理的病毒; 2: 未经MBCD 处理的病毒。b1 抗-gL 和抗-gQ1 单克隆抗体检测非还原状态的gL 和gQ11: MBCD 处理的病毒; 2: 未经MBCD 处理的病毒。 图 3 MβCD 对病毒包膜糖蛋白表达的影响

HHV-6对T淋巴细胞有亲嗜性，并因其亚型不同而导致细胞病变上的差异，原因在于HHV-6A包膜糖蛋白复合体与T细胞(HSB-2)的CD₄₆结合^[5]。HHV-6A病毒成熟的主要糖蛋白有多种，如gB,gH,gO，gL，gQ等，但比较重要的是gQ、gL^{[6, 7]} 。本实验检测结果显示，经MβCD作用和未经MβCD作用的HHV-6A，其gQ1和gL的表达水平未发生改变，表明即使病毒包膜胆固醇被去除，糖蛋白仍然存在，由二硫键连接的gL-gH复合体也未因胆固醇去除而受到破坏。提示MβCD可去除胆固醇，但不影响包膜糖蛋白的表达。

为了排除可能因MβCD对宿主细胞膜的影响而产生干扰，每次MβCD作用后的病毒，在感染细胞前均使用20%蔗糖缓冲液超高速离心去除MβCD，因此，推测MβCD不能通过抑制或干扰包膜糖蛋白的表达而达到阻止病毒与细胞受体结合的目的。至于MβCD去除包膜胆固醇后，对病毒结合、融合及进入细胞的影响尚有待于进一步研究。