男男性接触者（MSM）是人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）感染的高危人群之一。至2005年底，中国估计有HIV感染者65万，经性途径感染比例达到43.6%，2005年新发现的感染者中，经性传播的占49.8%，而MSM 中的HIV感染者已达4.7万人，并呈逐年上升趋势^[1] 。由于我国MSM人群具有多性伴、低安全套使用率和双性恋占相当比例的特点^{[2, 3]}，使得我国MSM人群中HIV更易于传播且易于成为向一般人群传播的桥梁，MSM人群中耐药株的流行情况可以从一定程度上反映新发HIV感染者中耐药株的传播情况。本研究对1999～2007年在中国医科大学附属第一医院随访的辽宁省46例MSM HIV-1感染者治疗前最后一次血样进行了耐药基因型研究。

1999～2007年在本院艾滋病门诊随访的辽宁省46例MSM HIV/AIDS患者，均由本艾滋病确认实验室经蛋白印迹方法（WB）确认。年龄18～70岁，平均年龄36岁。确认时间2004年前5例，2005年7例，2006年17例，2007年前8个月17例。所有病例均否认静脉吸毒和卖/输血史并签有知情同意书。采集血样时未接受任何抗艾滋病毒治疗。以乙二胺四乙酸三钾盐（EDTA-3K）抗凝管采集外周静脉血，立即混均，于6 h内常规离心抗凝血分离血浆，分装后-80℃冻存用于耐药基因型检测。

取140 μl血浆，以QIAamp Viral RNA Mini kit（德国Qiagen公司）；按照操作说明提取HIV基因组RNA，产物溶于60 μl洗脱液中。

RT-PCR反应体系：0.5 μl特异性下游引物RT-21(cTg TAT TTc Tgc TAT TAA gTc TTT TgA Tgg g 3509-3539)(50μmol/L)，MgCl2 2 μl(25 mmol/L)，10×RNA PCR Buffer 1 μl(100 mmol/L Tris-HCl pH8.3,500 mmol/L KCl)，dNTP混合物1 μl（10 mmol/L），AMV 逆转录酶XL 0.5 μl(5 U/μl)，RNA酶抑制剂0.25 μl(40 U/μl)，无RNA酶去离子水1.5 μl，4 μl提取的RNA模板，反应体积为10 μl，反应条件为：30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，一个循环。巢式PCR:外侧引物反应体系：外侧引物MAW-26(TTg gAA ATg Tgg AAA ggA Agg Ac 2028-2050)、RT-21 各3.125 μl (10 μmol/L)，10×PCR Buffer 2.5 μl(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3,500 mmol/L KCl)，TaKaRa Taq 酶0.125 μl(5 U/μl)，高压去离子水14.25 μl，5 μl提取的RNA，反应体积为25 μl。反应条件：94℃ 5 min，一个循环，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2.5 min，30个循环，72℃ 延伸10 min。内侧引物反应体系：内侧引物PRO-1(cAg Agc cAA cAg ccc cAc cA 2147-2166)、RT-20(cTg ccA gTT cTA gcT cTg cTT c 3441-3462)各12.5 μl(10 μmol/L)，10×Buffer 5 μl(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3,500 mmol/L KCl，MgCl2 25 mmol/L)，TaKaRa Taq 酶0.25 μl(5 U/μl) ，高压去离子水31.75 μl，dNTP混合物1 μl（10 mmol/L）,反应体积为50 μl。反应条件：94℃ 5 min，一个循环，94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 2.5 min，35个循环，72℃ 延伸10 min。QIAquick凝胶纯化试剂盒（德国Qiagen公司）；纯化巢式PCR产物。

以50 fmol纯化后PCR产物双脱氧终止法直接测序。测序试剂选用ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(法国Perkin-Elmer公司),测序引物选用PCR内侧引物，测序仪选用ABI 3130全自动DNA测序仪（美国ABI公司），按操作说明测定HIV-1蛋白酶1-99密码子和逆转录酶1-250密码子编码基因序列。

以Vector NTI9.0软件中Contig Express 组件进行序列拼接，参照测序谱图进行基因序列修订后，参考Los Alamos国家实验室HIV Sequence Database中2005年亚型参考株序列资料，MEGA 3.1进行Neighbor-joining方法鉴定基因亚型^[4]。将序列递交美国斯坦福大学HIV耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu/hiv/)在线分析耐药变异的位置和种类。

对蛋白酶和逆转录酶编码基因序列进行系统进化树分析表明，在46例HIV-1感染者中，有CRF01-AE 33例，B亚型10例，CRF07-BC 2例，B′亚型1例。

在蛋白酶编码区，有1例B亚型毒株携带L90M原发耐药变异，该变异引起奈非那韦（NFV）和沙奎那韦（SQV）中度耐药和阿扎那韦（ATV）、福沙那韦（FPV）、茚地那韦（IDV）低度耐药，该毒株同时还携带L10I、A71T次要变异。另1例CRF01-AE亚型毒株含有M46I原发耐药变异，该变异引起阿扎那韦和奈非那韦低度耐药，对福沙那韦、茚地那韦 、洛匹那韦（LPV）敏感性也有所降低。此外，还在2例CRF01-AE亚型感染者中发现L10I次要变异,其余感染者未发现蛋白酶抑制剂相关耐药变异。

在逆转录酶编码区，全部46例MSM中未发现携带明确的逆转录酶抑制剂相关的耐药突变。

尽管高效抗逆转录病毒治疗能够显著抑制HIV-1复制，延长患者生命，降低艾滋病死亡率，但如果不能完全抑制病毒复制，则容易导致继发性耐药性变异，而耐药株的复制是抗病毒治疗失败的主要原因之一。在欧美等发达国家，接受抗病毒治疗的感染者中耐药发生率已经在70%以上。耐药株可以在人群中传播，而新发感染者中出现原发耐药变异更是耐药株传播的直接证据。在欧美等发达国家，10%以上的新发HIV感染者对至少一种抗病毒药物耐药^[5-7]，而耐药株感染者抗病毒治疗失败的几率比敏感株感染者要高得多，以致于20%～50%的初次抗病毒治疗的病人及50%～76%已接受抗病毒治疗的病人不能持续控制病毒复制^{[8, 9]}。我国于2002年起陆续在艾滋病综合防治示范区开展了免费抗病毒治疗，并取得了较好的疗效^[10]，但是继发性耐药变异也明显增加。

目前MSM中HIV-1感染者多数人尚未进展到艾滋病期，接受抗病毒治疗的比例较低，对该人群尚未进行系统的耐药变异监测，因而其耐药变异株发生和流行情况尚不清楚。本研究在国内首次报告了在我国MSM 人群的HIV 感染者中已经有耐药株传播，并且发现在B亚型和CRF_01AE中皆有原发耐药变异存在。CRF01AE亚型的耐药病例于2004年确认感染HIV-1,B亚型的病例于2007年确认。由于此2例原发耐药变异位点均位于蛋白酶编码区，而我国免费抗病毒治疗的一线方案中并不包含蛋白酶抑制剂，2例感染者均否认任何抗病毒治疗史，都支持了这2例感染者为原发耐药。2例感染者均否认与外国人有过直接性接触，排除直接外来输入的可能，但2人均称与不熟悉的人有过性接触，因而有理由推测在辽宁省MSM人群中已存在HIV耐药株的传播。本研究发现该人群中已有耐药株传播的情况应引起重视，一方面对MSM人群开展抗病毒治疗前应进行耐药基因型检测，另一方面要加大干预措施，控制耐药株的进一步传播。