近年来，随着大量广谱抗生素、皮质激素、免疫抑制剂的应用，血液系统恶性疾病、器官移植和艾滋病患者的增加，侵袭性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)逐年增多，其发病率和死亡率居高不下，严重危害人类的健康^{[1, 2]}。绝大多数IFI病人无特异的临床表现，很难与其他侵袭性疾病区分。真菌感染的诊断依靠常规真菌分离、培养和组织病理鉴定，难以满足临床工作的需要，研究和探索敏感、特异的早期快速诊断方法已成为IFI实验室研究领域的热点和难点^[3-5]，病原真菌鉴定到种的水平也具有临床治疗和流行病学研究的双重意义。本文就近年来IFI实验室在快速诊断方面的研究进展综述如下。

1 快速鉴定培养方法

由于分子生物学方法缺乏规范化，检测的敏感性和特异性报道不一，且不能帮助判断检测的阳性结果是感染还是定植，在检测过程中易出现假阳性和假阴性，因此，还不能取代传统鉴定方法应用于临床，尤其是血培养方法仍然是临床检测真菌血症的金标准。因此，许多研究者致力于传统方法的改进以求更加准确、快速的鉴定侵袭性真菌。快速培养鉴定法包括：(1)吐温酵母肉汤培养基(TYB培养基)：利用白色念珠菌在人血清中形成芽管这一特点，30min可判定结果。(2)特异性酶法：有MUAG Candi试剂盒和Albistrip试剂条3～5min可以检测白色念珠菌。Niimi等^[6]利用部分真菌具有一种水解酶β-N-乙酰氨基己糖苷酶活性，用对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷作底物检测此酶。在微量滴定板中进行的这一反应可将白色念珠菌和都柏林念珠菌与其他菌种分离开来。(3)糖同化实验：使用Rosco诊断试纸条4h可鉴定光滑念珠菌。(4)吐温80浊度实验：可鉴定致病性念珠菌。

2 血清学检测 2.1 抗体检测

用于常见条件性侵袭性真菌感染，早期诊断价值不大，难以达到较高的敏感性和特异性。但真菌抗体检测对某些地方性条件性真菌感染显示出一定的应用价值。Yeo SF等利用从真菌提取的天然抗原，成功建立了多种地方性真菌病血清学检测方法，用于包括芽生菌病、球孢子菌病，组织胞浆菌病、副球胞子菌病和毒霉病的早期诊断及流行病学调查，并显示出较高的敏感性和特异性^{[7, 8]}。

2.2 抗原检测

半乳甘露聚糖(GM)是第一个用于侵袭性曲霉菌病的抗原。应用单克隆抗体和夹心ELISA可提高检测敏感性。Busca A报道^[9]，对异基因干细胞移植病人常规检测曲霉菌半乳甘露聚糖抗原(AGA)，若发热超过3 d、抗菌治疗无效则再做胸部CT扫描，两者结合可提高侵袭性肺曲霉的诊断效率，早期提示进行抗真菌治疗，可延长病人的生存期。Hart KA等^[10]用曲霉菌的半乳甘露聚糖酶免疫分析法检测了76个病人的986份血清标本，结果表明，以0.5为阳性临界值可提高检测的敏感性和特异性。因GM血症常为一过性，故应对高危人群进行动态监测。

除检测曲霉的半乳甘露糖抗原外，目前检测的真菌抗原还有烯醇化酶、(1->3)-β-D-葡聚糖、甘露糖和不耐热抗原等。(1)烯醇化酶：是糖酵解所必需的细胞内酶，广泛存在于真菌细胞中。检测念珠菌血症患者血中烯醇化酶抗原可使用多克隆抗体采用斑点免疫结合法或双夹心脂质体免疫分析，阳性率71.8%～75％。在健康和免疫缺陷的混合人群中，以血清中是否含有抗烯醇化酶抗体来诊断深部念珠菌病，其特异性和敏感性可达96.4％和81.5％^[11]。动态监测患者血清中抗烯醇化酶抗体和抗体滴度可提高临床应用价值。(2)(1->3)-β-D-葡聚糖(BG)：BG是除接合菌和隐球菌以外的真菌胞壁的主要成分之一，不存在于细菌、病毒和人类细胞中，在人体液、血液和组织中能被检测，是一种真菌广谱循环标志物。有多种商业化方法检测BG，可用于念珠菌病及曲霉菌病的早期诊断^[12-14]。(3)甘露糖：甘露糖广泛存在于细胞壁中，是真菌细胞壁的重要组成成分，已有多种血清学方法用于外周血中甘露糖的检测^[15]，同时检测甘露糖抗原和抗体有助于提高诊断的阳性率。(4)不耐热抗原：Cand-Tec抗原是指可用念珠菌属检测系统检测的一类念珠菌蛋白抗原。Cand-Tec MT微滴度法是一种早期诊断深部真菌感染和准确评价治疗效果的有效方法^[16]。但Cand-Tec的敏感性和特异性报道不一，且类风湿因子可产生假阳性，加之其靶抗原的属性和功能不明，限制了其进一步发展。

从血液、支气管肺泡灌洗液或其他体液中检测并定量分析真菌抗原是IFI早期诊断的方法。被检测的理想真菌抗原应具备以下几方面：(1)侵袭性真菌感染早期即显著升高，且病情发展中持续存在；(2)检测阳性时能提示感染，而不受真菌定植的影响；(3)真菌抗原高度保守，与人体或其他微生物成分无交叉反应；(4)抗真菌治疗前抗原应显著升高，治疗有效后能逐渐或显著降低，以帮助监测疗效；(5)所构建的方法稳定、实用、易于推广^[17]。GM抗原、BG抗原检测在丝状真菌中应用较多，但尚无一种完全符合上述条件的抗原用于IFI的诊断。

真菌抗原检测需要解决如下问题：(1)体内免疫复合物的形成可清除抗原而降低敏感性，故检测前应尽量使免疫复合物解离。(2)应用多抗难以避免批间变异及交叉反应，故应用单抗或多价的表位特异性抗体。(3)检测方法的敏感性尚需改进。(4)方法应简便、适用，实验室内和室间的变异要小。(5)需要更多的临床证据以明确试验的诊断价值。

2.3 真菌代谢产物检测

主要包括D-阿拉伯醇(D-arabinitol)、L-阿拉伯醇(L-arabinitol)和甘露聚醇(mannitol)。以酶荧光法定量检测D-阿拉伯醇脱氢酶，可快速诊断侵袭性念珠菌病^[18]。在其他系统性真菌感染中该产物也同样增高，提示可以作为诊断手段之一。Jegoroy A等指出^[19]，由于在早期真菌感染阶段缺乏可靠的分子生物学工具，使用质谱分析，可根据特异真菌代谢产物快速鉴定40多个不同真菌菌株。

3 分子生物学方法

近年来，分子生物学技术已成功地应用于某些深部真菌感染的诊断检测，可以简便、快速地鉴定多种医学重要真菌^[20]，广泛应用于病原真菌的分型、鉴定和亲缘关系研究。(1)聚合酶链反应-单链构象多肽性分析(PCR-SSCP)：Walsh^[21]曾报道，用PCR-SSCP技术检测真菌。应用PCR-SSCP技术可将曲霉鉴定到属的水平，并可一次性对烟曲霉和黄曲霉进行鉴别。(2)随机扩增多肽性DNA(RAPD)分析：RAPD分析是利用随机合成的单个寡核苷酸引物(8～12bp，多为10bp)，通过PCR扩增靶核苷酸细胞DNA，经凝胶电泳进行DNA片断大小及数量的多肽性分析，已应用于酵母菌及曲霉菌的鉴定、分类和流行病学研究，该法简便、易解释，便于大规模使用^[22]。但重复性相对较差，一般采用多种随机引物进行PCR扩增和与其他方法联合应用，可以克服稳定性差的弱点。(3)限制性片段长度多态性分析(RFLP)：核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，其中Ⅱ型酶为通常所指的DNA限制性内切酶；酶切后产生特异的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳形成酶切图谱。而不同种属的真菌基因组DNA顺序存在差异，可在酶切图谱上反映出来，借此可对相近菌种或同种内变种进行分析^[23]。(4)mRNA差异显示逆转录PCR：mRNA差异显示逆转录PCR技术是一种在转录水平上研究基因差异表达的方法，该方法已成为医学真菌分子生物学研究的良好工具^[24]。运用该技术已经寻找到白色念珠菌、曲霉等真菌的一些致病相关基因。并有助于了解系统性真菌病的致病机制、开发新的抗真菌药物、真菌疫苗的研制、真菌病的早期诊断和早期治疗。近年，实时定量逆转录PCR技术已成为RNA定量检测的最常用方法之一^[25]。(5)实时荧光定量PCR(real-time PCR)：实时荧光定量PCR技术即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，可对临床重要曲霉菌和念珠菌进行区分^[26]。Carr^[27]应用实时定量PCR方法诊断由念珠菌感染而引起的心内膜炎；Jordanides^[28]用该法对78例血液肿瘤病人真菌感染进行早期诊断，敏感性为75％，特异性为70％；Sanguinetti^[29]用该法对肺泡灌洗液进行处理，诊断侵袭性肺曲霉病(IPA)，阳性率为90％。随着实时PCR技术的完善和发展，可以快速、灵敏、定量的诊断侵袭性真菌感染，并实施疗效监控。(6)巢氏PCR：如选用单拷贝基因为靶，用巢氏PCR，其敏感性比普通PCR要高1000倍。赵军等采用自行设计的烟曲霉特异性引物用巢氏PCR技术快速诊断侵袭性烟曲霉感染，在临床确诊或拟诊的侵袭性曲霉感染患者中，检测灵敏度和特异性分别为100％和83.3%^[30]。但要特别避免出现假阳性，环境中存在的大量曲霉孢子易造成检测样本或诊断试剂污染，应注意严格的实验室检测规范以及设置对照。

4 结语

目前，侵袭性真菌感染诊断技术仍十分有限，理想的诊断方法应该具备快速、简便、敏感、特异等特点，对临床出现的侵袭性真菌感染应联合应用多种技术来进行检测。血清学检测具有简便快速的特点，对真菌感染来说，抗原检测可能是最有前途的一项实验诊断措施，己开发出部分商品化的试剂盒，但各种检测方法的敏感性和特异性尚需广泛证实。PCR及其相关技术可快速、敏感、特异的检测出真菌感染，但是PCR过程中也存在一些问题，如检测过程缺乏规范化，极少量的污染便可出现假阳性结果，检测的敏感性和特异性报道不一；有些真菌是机会致病性真菌，检测的阳性结果不能判断感染还是定植。因此，PCR结果必须结合患者的临床表现和其他的检查结果，才能作出正确的判断。相信随着实验室诊断技术的不断改进和创新，有关侵袭性真菌的研究将取得更大的进展。