2007, Vol. 23
2. 山西省疾病预防控制中心;
3. 山西省第二人民医院
肿瘤治疗中传统的放疗和化疗都不可避免地会造成血液系统和消化系统的损害，对免疫系统造成进一步的损伤，并且不能完全消除残存的肿瘤细胞[1]。为寻找其替代品，许多学者对抗菌肽抗肿瘤作用机制进行了探讨[2-4]。本文提取了家蝇蛹体中含有抗菌肽的活性成分并作用于4种肿瘤细胞,用扫描电镜观察其表面变化,以期直观地研究抗菌肽对肿瘤细胞的杀伤机制。
1 材料与方法 1.1 材料家蝇（Musca domestica）多代培养的纯种品系（山西省疾病预防控制中心）；大肠埃希菌（Escherichia coli 8099）（军事医学科学院流行病研究所）；人髓样白血病细胞株（K562）、人淋巴瘤细胞株（Daudi）、人食癌细胞株（Eca109）、人膀胱癌细胞株（T24）4种肿瘤细胞。（中国医学科学院北京药物所引进）。苯甲基磺酰氟（PMSF）试剂（美国Sigma公司）；阳离子交换纤维素CM-52（中国北京来宝生物试剂有限公司）。
1.2 方法 1.2.1 抗菌物质的诱导[5]取4龄家蝇幼虫400条，以0.15 mol/L浓度的大肠埃希菌液醮沾刺伤幼虫，然后将其放回新鲜配制的麸皮饲料培养，待其化蛹后备用。
1.2.2 抗菌物质的提取血淋巴中抗菌肽提取[6]：将家蝇蛹置于研钵中，加苯甲基磺酰氟，再加入10 ml生理盐水研磨，于4℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清；沸水浴中加热3 min，离心，取上清，备用。阳离子柱层析[7]：磷酸缓冲液平衡羧甲基纤维素CM52层析柱，加样本，加洗脱液，上样量为100 ml，每管收集2 ml，洗脱速度为1 ml/min，取第14～18管抑菌活性强的样品。测定每管收集液的抑菌活性及280 nm紫外吸收光值。
1.2.3 抑菌活力测定[8]在营养琼脂培养基上接种大肠埃希菌，再将直径为3 mm的药敏纸片上滴加2 μl制备好的家蝇幼虫血淋巴，37℃培养24 h，观察并测量抑菌圈大小。
1.2.4 电镜观察经离心、固定、脱水等处理后用扫描电子显微镜观察4种肿瘤细胞的表面变化。
2 结果 2.1 抑菌活力所提抗菌肽浓度为6.51 g/L。抑菌圈显示所提取的抗菌肽有一定的抑菌作用。
2.2 对4种肿瘤细胞的扫描电子显微镜观察（图 1～4）电镜观察结果显示，被抗菌肽作用后的4种肿瘤细胞在不同程度上都受到损伤，且约60%的受伤细胞为穿孔型损伤。结果提示，家蝇蛹中所含的抗菌肽杀伤肿瘤细胞的机制可能是破坏细胞膜。
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图 1 穿孔人髓样白血病细胞株(×8000)( |
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图 2 破损人淋巴瘤细胞株(×8000) |
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图 3 穿孔人食管细胞株(×8000) |
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图 4 受伤人膀胱癌细胞株(×8000) |
3 讨论
许多国内外学者对抗菌肽作用于肿瘤细胞的机制进行了研究。众多的假说中有2种说法得到了普遍认同：(1)破坏肿瘤细胞内部结构。抗菌肽除了对癌细胞的膜损伤外，还可能诱导核染色体DNA断裂，并抑制染色体DNA的合成，细胞骨架也受到一定程度的损伤[9]。(2)提高机体免疫力。抗菌肽还可以调动机体的免疫机能[8]，从体液免疫方面来抵抗肿瘤的侵染。已有实验证明，荷瘤小鼠注射抗菌肽后脾指数进一步提高。
本试验构成了对破坏膜结构理论的支持，但并没有否定其他的2种假设。也许各种抗菌肽的作用机制略有不同，上述几种假设都有其正确的一面。从电镜中观察受试细胞的表面，看到约60%以上的破损细胞为表面孔洞型，似乎可以更明确地说明有穿孔机制的存在。
抗菌肽是迄今为止许多学者最看好的一类抗生素替代品，因其优良理化性质、广谱抗菌、以及对人体无毒副作用或作用甚小等特性。家蝇作为昆虫抗菌肽最常用的实验材料，已被在其幼虫和成虫中提取过抗菌肽。本实验选取了蝇蛹抗作为实验材料，以了解、开发和利用家蝇抗菌肽。在抗菌肽抗肿瘤药物的研发领域中，随着对其抗肿瘤机制的进一步研究，这类药物会产生较好作用。
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