2007, Vol. 23
睡眠和觉醒周期性是人类和大多数哺乳动物生存的必要条件。睡眠剥夺在夜班作业以及多种职业人群中均属于常见的应激原。有文献表明,睡眠剥夺可引起机体免疫力下降,警觉性和判断力下降,记忆力下降等变化[1, 2]。为研究睡眠剥夺对海马锥体细胞形态结构的影响,探讨睡眠剥夺后神经元损伤的机制,为睡眠剥夺损伤的防治提供依据,进行了本研究。
1 材料与方法 1.1 动物及分组选用成年健康SD 大鼠54 只,雌雄不拘,体重(180 + 20) g (第四军医大学实验动物研究中心) 。将54只大鼠随机分为6 组,1 组为正常对照组,其余5 组分别进行睡眠剥夺1～5 d ,每组9 只大鼠。饲养环境:室内温度和湿度均控制在适宜范围内[3],同时避免噪音,保持24h 光暗周期。
1.2 制备大鼠异相睡眠剥夺的模型采用多平台水环境法(Modifield multiple platform method)[4],制作大鼠异相睡眠剥夺模型。睡眠剥夺箱(30 cm ×30 cm ×150 cm) 中央放置直径为415 cm ,高8 cm 的平台数个。剥夺箱内注有水,水面低于平台2 cm ,水温保持在(20 ±2) ℃。大鼠可以在平台上活动,自由摄取食物和水,但当进入睡眠时,由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而惊醒,造成异相睡眠剥夺。
1.3 海马CA1 区锥体细胞形态的观察睡眠剥夺后,各时段大鼠均以2 %戊巴比妥钠进行腹腔麻醉,迅速开胸暴露心脏,行左心室插管经右心耳放液,先以肝素化生理盐水50～100 ml 冲去血液,再以4 %多聚甲醛磷酸缓冲液(011 mol/ L pH 714 ,4 ℃) 200～250 ml 灌注固定30～40 min 取脑组织。脑组织置于同种固定液中续固定(4 ℃,2 h) ,再置于20 %蔗糖溶液(011 mol/ L pH 714 ,4 ℃) 过夜。按PaXinos 立体定位图谱取海马,恒冷切片机连续冠状切片(Bregrnan 平面后318mm) ,片厚15μm。采用尼氏(Nissl) 染色,光镜下观察海马CA1 区锥体细胞形态的变化。
1.4 海马CA1 区锥体细胞超微结构的观察睡眠剥夺后,将各组大鼠戊巴比妥钠(40 mg/ kg) 腹腔麻醉后,断头处死,迅速取出海马,按电镜样品取材要求,3 %戊二醛、1 %锇酸双固定,常规包埋,光镜选区,制备超薄切片,铀、铅双染,100CX2II型透射电镜观察并照相。
1.5 海马CA1 区线粒体损伤后细胞色素C 水平的变化按常规链霉亲和素免疫组化法(SABC) 进行检测,按免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司) 说明书操作。二氨基联苯氨(DAB) 显色。
2 结果 2.1 睡眠剥夺对大鼠海马神经元形态的影响正常对照组的海马CA1 区神经元呈梭形紧密排列,细胞轮廓清晰,胞浆透明。随睡眠剥夺时间的延长,神经元数目减少,排列紊乱,细胞轮廓模糊,出现大量空泡。
2.2 睡眠剥夺对海马CA1 区锥体细胞超微结构的影响(图 1,2)
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图 1 睡眠剥夺后,电镜观察海马CA1 区内质网及粒体的超微结构的改变( ×1 0000) |
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图 2 睡眠剥夺后,电镜观察海马CA1 区轴突超微结构的改变( ×1 000) |
睡眠剥夺后,海马CA1 区内质网扩张;轴突水肿明显;线粒体数目明显减少,线粒体肿胀,嵴结构模糊,紊乱,有的呈空泡样变。
2.3 睡眠剥夺对海马CA1 区锥体神经元内细胞色素C 的影响(图 3)
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图 3 睡眠剥夺后,海马CA1 区免疫组化染色( ×400) |
应用免疫组织化学法检测各组大鼠海马神经元内细胞色素C 的变化。结果显示,随着睡眠剥夺时间的延长,细胞色素C 免疫阳性的神经元较对照组逐渐增多,提示细胞线粒体损伤导致细胞色素C 释放入胞浆。
3 讨论在中枢神经系统中,海马是介导应激反应的最重要的脑区之一[5]。海马与学习记忆功能密切相关,对认知性应激反应尤为重要。本研究结果显示,睡眠剥夺组大鼠海马AC1 区锥体细胞排列松散,尼氏小体减少或者消失。尼氏小体是细胞合成蛋白质的场所,它的结构正常与否能够反映细胞的功能状态[6]。本实验结果证明,睡眠剥夺组的海马CA1 区锥体细胞形态发生破坏,这可能是睡眠剥夺影响学习记忆功能的机制之一。另外,透射电镜观察结果显示,睡眠剥夺后海马CA1 区的血管、轴突、线粒体等的超微结构发生异常的改变,而线粒体的损伤较为明显。免疫组织化学方法也证明神经元胞浆内细胞色素C 免疫阳性增强,表明线粒体损伤后细胞色素C 释放入胞浆[7]。本实验中睡眠剥夺后,海马神经元形态功能异常变化,线粒体受损,释放细胞色素C 至胞浆,在某种因素作用下,激活凋亡程序引起海马神经元的凋亡[8],可能与学习记忆功能密切相关,有待进一步研究。细胞色素C 是线粒体呼吸链中的一个基本成分,位于线粒体膜内并松散地附着于线粒体膜的内表面,被认为是哺乳动物细胞凋亡信号传导过程的关键因素[9]。线粒体损伤后,线粒体膜间隙的细胞色素C 释放入胞浆,与Apaf-1 结合,并激活caspase29 ,后者又激活由caspase23 介导的凋亡过程[10]。
研究表明,睡眠剥夺可引起大鼠学习记忆功能的降低,但其作用机制尚不完全清楚。本实验结果表明,睡眠剥夺可引起大鼠海马神经元超微结构的损害,线粒体的损伤更引起细胞色素C 的释放,影响神经元的存活状态,在一定程度上可解释睡眠剥夺影响学习记忆的机制。另外,线粒体是能量供应的中心,也是神经元维持正常生理功能的重要细胞器[11],改善线粒体功能可望成为睡眠剥夺损伤防治的一条新途径。
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